脑组织冰冻切片

各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。

不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。

再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。

设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。

冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。

在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。

防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。

而且产生冰晶。

2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。

西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。

3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。

一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。

不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。

楼上的几位同仁说得不错。

就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点：1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。

神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。

丁香园上面总结的方法,排版有点乱.其实过程与大鼠近似，我的经验是：1。

材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；2. 步骤：处死小鼠，取头颅；剪开皮肤，漏出颅骨;用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。

3。

注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。

做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多，要固定的好,就需要先灌注.先麻醉小鼠剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。

具体步骤:常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。

然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。

用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室,注射，注射时小心针头滑脱。

生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。

然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束,小鼠僵硬即可。

取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。

形态学方法免疫组织化学实验对象：冰冻切片步骤1、室温下复温30min，0.01MPBS清洗5min×3；2、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3；3、5%小牛血清封闭1h0.01MPBS清洗5min×3；3、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml)稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MPBS洗5min×3；4、加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）3 0min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；5、加入0.01MPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。

0.01MKPBS洗5min×3；6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

细节将消除内源性过氧化物酶这一步放在后面，能避免双氧水对目的蛋白的影响1）实验技术大类：形态学（2）具体实验技术名称：冰冻切片（3）实验对象：脑组织（4）简要实验步骤1. 经心脏生理盐水灌注取脑，对半切开，4%多聚甲醛浸泡固定（4℃）2. 20％、30％蔗糖/0.1M PB溶液梯度脱水、直至标本在标本瓶中沉底。

3. 标本在30％蔗糖/0.1 mol/L PB溶液脱水至沉底后取出，滤纸吸干表面水分。

4. 标本经OCT包埋剂包埋，连续冠状位切片（5）我的经验或者心得体会：1. 脑组织相对于其它器官含水量尤其丰富，冰冻切片时冷冻的速度要快，冻结的速度越慢，冰晶形成越多。

提高脑组织冰冻切片质量的几点体会一、本文概述脑组织冰冻切片技术是一种广泛应用于神经科学研究的重要实验手段，其质量直接影响到后续的实验结果和数据分析。

然而，由于脑组织结构的复杂性和特殊性，冰冻切片过程中往往面临着诸多挑战，如切片厚薄不均、组织变形、细胞结构破坏等问题。

本文旨在分享在脑组织冰冻切片实践中积累的经验和体会，探讨提高切片质量的关键环节和操作技巧。

通过对冰冻切片前处理、切片过程、切片后处理等关键步骤的详细阐述，本文旨在为神经科学研究者提供一套行之有效的脑组织冰冻切片方法，以期提高切片质量，为后续实验提供可靠的基础。

二、脑组织冰冻切片的基本原理和技术要点脑组织冰冻切片是一种在低温条件下对脑组织进行快速冷冻，然后进行切片的技术。

其基本原理是利用低温使组织迅速固化，保持组织的原始结构和细胞形态，以便后续的观察和分析。

这一技术广泛应用于神经科学研究、病理学诊断和药物研发等领域。

技术要点方面，选择合适的固定液对脑组织进行固定是至关重要的。

常用的固定液如4%的多聚甲醛可以有效地固定脑组织，保持其结构稳定。

快速而均匀的冷冻过程也是关键。

这通常通过使用液氮或冷冻机实现，以最大程度地减少冰晶形成对组织结构的破坏。

在切片过程中，选择适当的切片厚度和温度也是非常重要的。

一般来说，切片厚度在10-50微米之间，而切片温度则需要在-20℃到-30℃之间。

对切片进行后处理，如染色、封片等，也是提高切片质量的重要步骤。

脑组织冰冻切片技术需要严格的操作流程和精确的控制，以确保切片的质量和准确性。

通过不断地优化技术和积累经验，我们可以进一步提高脑组织冰冻切片的质量，为神经科学研究和病理学诊断提供更可靠的支持。

三、提高脑组织冰冻切片质量的措施脑组织冰冻切片是神经科学研究中的一项重要技术，其质量直接影响到后续的实验结果和数据分析。

为了提高脑组织冰冻切片的质量，我们采取了一系列措施，并取得了显著的成效。

在取材过程中，我们严格控制取材时间，确保脑组织在死亡后尽快被取出并处理。

不同组织的冰冻切片体会来源：第三军医大学大坪医院病理科作者：毛成毅，杜娟，肖华亮，李增鹏冰冻切片原理：组织被冷冻时，组织中的水变成冰，而在这种状态中，组织变坚硬的。

冰冻块的硬度可通过改变组织温度来改变。

降温会使组织块更加坚硬，提高温度使组织变软。

大多数非脂肪不固定组织的切片最好在-20到-25℃制作。

因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，多应用于手术中的快速病理诊断。

冰冻切片的制作过程中，常有许多因素影响其质量，并进一步影响结果的观察和分析，甚至会影响诊断，造成无法挽救的后果，对此我们经过比较及总结得出如下经验。

冰冻温度及组织冰冻的时间对冰冻切片质量的影响是至关重要的。

冰冻温度对细胞的影响：温度太低，细胞容易收缩，温度太高，细胞容易膨胀，结构不清，模糊，影响冰冻诊断。

充分利用冷冻台、冰锤及速冻头的功能。

将放有新鲜组织的冻托放在冻台上然后压上压板，等组织冻住后，轻敲压板，冻有组织的冻托就会下来，然后进行切片。

在实际工作中，一般冰冻机温度设定如下：冻台温度：-18℃；工作温度：-18℃；冻头温度：-20℃。

（一）乳腺组织的冰冻切片乳腺组织（纤维腺瘤，间质胶原化）含纤维组织较多，冰冻切片染色时容易脱片。

1、使用免疫组化防脱载玻片进行贴片，冰冻切片脱片率明显下降。

2、乳腺含脂肪组织比较丰富，在冰冻切片时不容易成片或展片。

3、乳腺组织在取材时，取材医生应尽量将病变周围的脂肪组织剔除。

4、当遇到脂肪组织较多，又无法剔除时，建议使用液氮。

5、充分利用冰冻切片机（速冻台）的功能。

（二）子宫肌瘤的冰冻切片1、温度的控制：冷冻温度是冰冻切片的关键；冷冻室温度设定-17~-22度；控制肌瘤组织冷冻时间，4/5组织冻好就可以；冷冻过头时拿出冷冻室解冻软化一下。

2、包埋剂(OCT)的使用：冻头中心滴好OCT粘好组织块，再在周围加固一圈；虽然有可能加长了冷冻时间，但可以将组织牢牢固定住；修片时不能太厚，要用慢进；防止修片和切片时产生的抖动。

1、冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。

因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。

冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。

这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。

当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。

编辑本段冰冻切片的应用（1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。

（2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。

（3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。

（4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。

（5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。

（6）某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。

（7）神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal 氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。

（8）对某些物质所进行的免疫荧光的研究。

编辑本段冰冻切片的制作方法低温恒冷箱冷冻切片制作法以Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机为例，该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。

启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。

有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。

配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。

当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。

除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。

脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪【摘要】目的：：比较脑组织冰冻切片与石蜡切片免疫组化的效果。

方法：健康雄性昆明小鼠20只，腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态模型。

24h后成功模型小鼠脑灌注固定，断头取脑，随机分别取8只行冰冻切片40μm (A组)与石蜡切片4μm (B组)，采用羊抗鼠 DCX (1：200)抗体，以 SABC 法进行免疫组化染色。

结果：A组阳性神经元数目与B组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且 A组镜下视野切片染色更加清晰，对比良好。

结论：脑组织切片免疫组化染色采用冰冻切片漂片法效果更为可靠。

【期刊名称】《长江大学学报（自然版）理工卷》【年(卷),期】2015(000)036【总页数】3页(P95-97)【关键词】冰冻切片;石蜡切片;免疫组化;癫痫【作者】钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪【作者单位】长江大学医学院，湖北荆州 434023;长江大学医学院，湖北荆州434023;长江大学医学院，湖北荆州 434023;长江大学医学院，湖北荆州434023;长江大学医学院，湖北荆州 434023【正文语种】中文【中图分类】R361随着神经科学的不断发展，脑组织免疫组化技术越来越多地应用于神经学研究。

由于脑组织本身具有柔软、含水量大等特点，其石蜡切片的免疫组化染色结果易出现切片染色不清楚、脱片、假阳性、假阴性等问题[1]，很难得到高质量的脑组织免疫组化切片。

本实验采用癫痫持续状态模型(status epilepticus, SE)，用免疫组化的方法检测海马齿状回下区编码微管相关蛋白(DCX)阳性神经元的表达，对比脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法免疫组化的效果，以期更好的开展实验研究工作。

1.1 对象健康雄性昆明小鼠20只，体质量(30±5)g，由湖北省实验动物研究中心提供；东莨菪碱、匹罗卡品由Sigma公司提供；免疫组化ABC试剂盒、DCX羊抗鼠一抗、驴血清、驴抗羊二抗由Santa cruze公司提供。

实验技术：组织切片的制备点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考，谢绝转载，否则责任自负组织切片的制备二）切片方法-细节注意1 切片方法的选择光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。

1.1 冰冻切片是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。

冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。

冰晶小而多，对组织结构损害大。

因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。

具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。

用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。

将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。

此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。

②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

冰冻切片一般用恒冷切片机。

切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。

【目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。

【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。

有关细胞和组织学技术一、细胞和组织免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目织标本质量的好坏有着密切的联系。

由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。

因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十（一）细胞标本的取材目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。

应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。

近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、研究均起到了积极作用。

细胞标本的取材有以下3种方法:1．印片法主要应用于活组织检查标本和手术切除标本。

新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，玻片上，立即浸入细胞固定液内5-10min，取出后自然干燥，低温保存备用。

优点是简便省时，细胞抗原保存较好。

缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞重叠，影响标记效果。

2．穿刺吸取涂片法主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。

用细针穿刺吸抹在载玻片上，力求细胞分布均匀。

如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法：将穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液（低速离心5-10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（浓度约2×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。

缺点是细胞分布不均匀。

洗涂法片虽可弥补3．体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。

体液采取后，必须量的多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上。

②细胞数量较少者，可将液体自离心10min，弃上清液，将沉淀涂片，略干后固定备用。

如用细胞离心涂片器(Cytospin )，可将标本用上述离心沉淀法制成2×106细胞/ml的细胞悬液，吸取50μl加入细胞分布在直径约6mm的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约105个(Danos,1976)。