H9亚型禽流感病毒黏膜DNA疫苗与灭活油乳苗的联合免疫研究

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(９):１９０１￣１９０７ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张雪花ꎬ王卫华ꎬ武㊀奇ꎬ等.Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(９):１９０１￣１９０７.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０９.０１２Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力张雪花１ꎬ２ꎬ㊀王卫华１ꎬ３ꎬ㊀武㊀奇１ꎬ２ꎬ㊀李㊀丁１ꎬ２ꎬ㊀平继辉３ꎬ㊀梅㊀梅１ꎬ２(１.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ２.兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心ꎬ江苏泰州２２５３００ꎻ３.南京农业大学动物医学院ꎬ江苏南京２１００９５)收稿日期:２０２３￣０３￣２３基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２２)３０３１]作者简介:张雪花(１９８２－)ꎬ女ꎬ山东郓城人ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事动物免疫学及兽用生物制品研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｎｇｘ￣ｕｅｈｕａ１２１３＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:梅㊀梅ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊａｃｑｕｉ１８＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒(ＡＩＶ)变异快㊁传染性强ꎬ由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果ꎬ导致Ｈ９Ｎ２亚型禽流感时有发生ꎮ为研发具有广谱保护性的Ｈ９亚型禽流感疫苗ꎬ本研究利用生物信息技术ꎬ对Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ基因序列进行分析ꎬ设计获得ＨＡ基因序列ꎮ将ＨＡ基因构建于杆状病毒表达系统ꎬ表达的重组ＨＡ蛋白血凝效价为１ˑ２１２ꎬ与不同分支Ｈ９亚型ＡＩＶ阳性血清具有良好的交叉反应活性ꎮ将重组蛋白制备成疫苗(ｒＨＡ疫苗)免疫１０日龄雏鸡ꎬ免疫后２８ｄ将不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ流行毒株１１５和ＹＺ株分别以１ˑ１０６ＥＩＤ５０(半数鸡胚感染量)感染试验鸡ꎬｒＨＡ疫苗组交叉保护效力明显优于商品苗组ꎮ本研究结果表明Ｈ９亚型禽流感广谱型亚单位疫苗具有较好的应用前景ꎬ可以用于防控Ｈ９ＡＩＶ感染ꎮ关键词:㊀Ｈ９亚型禽流感ꎻＨＡ基因ꎻ杆状病毒表达系统ꎻ广谱亚单位疫苗ꎻ免疫中图分类号:㊀Ｓ８５２.６５㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０９￣１９０１￣０７ＡｎｔｉｇｅｎｄｅｓｉｇｎａｎｄｉｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆａｕｎｉｖｅｒｓａｌｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＨ９ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＺＨＡＮＧＸｕｅ￣ｈｕａ１ꎬ２ꎬ㊀ＷＡＮＧＷｅｉ￣ｈｕａ１ꎬ３ꎬ㊀ＷＵＱｉ１ꎬ２ꎬ㊀ＬＩＤｉｎｇ１ꎬ２ꎬ㊀ＰＩＮＧＪｉ￣ｈｕｉ３ꎬ㊀ＭＥＩＭｅｉ１ꎬ２(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ/ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＦｏｏｄＱｕａｌｉｔｙａｎｄＳａｆｅｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧｕｏＴａｉ(Ｔａｉｚｈｏｕ)ＣｅｎｔｅｒｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｎｏ￣ｖａｔｉｏｎｆｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓꎬＴａｉｚｈｏｕ２２５３００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００９５ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅＨ９Ｎ２ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ(ＡＩＶ)ｅｖｏｌｖｅｄｒａｐｉｄｌｙｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙꎬａｎｄｔｈｅｉｎａｃ￣ｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｃｏｕｌｄｎｏｔｐｒｏｖｉｄｅｃｏｍｐｌｅｔｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔꎬｗｈｉｃｈｌｅｄｔｏＨ９Ｎ２ＡＩＶｅｐｉ￣ｄｅｍｉｃｓｏｃｃｕｒｒｉｎｇｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ.Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＨ９ＡＩＶꎬｔｈｅＨＡｇｅｎｅｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｓｏｆＨ９ＡＩＶｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬａｎｄＨＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｏｂ￣ｔａｉｎｅｄ.ＴｈｅＨＡｇｅｎｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍꎬａｎｄｔｈｅｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｉｔｅｒｏｆｒＨＡｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ１ˑ２１２.ＴｈｅｒＨＡｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｒａｎｃｈｅｓｏｆＨ９ＡＩＶ.Ｔｅｎ￣ｄａｙ￣ｏｌｄｃｈｉｃｋ￣ｅｎｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｒＨＡｐｒｏｔｅｉｎ.Ａｆｔｅｒ２８ｄａｙｓｏｆｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎꎬｔｅｓｔｉｎｇｃｈｉｃｋｅｎｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ１ˑ１０６ＥＩＤ５０ｏｆＨ９ｓｕｂｔｙｐｅＡＩＶｓｔｒａｉｎ１１５ａｎｄｓｔｒａｉｎＹＺꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｒＨＡｖａｃｃｉｎｅｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｖａｃｃｉｎｅｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｔｈｅｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＨ９ｓｕｂ￣ｔｙｐｅＡＩＶｈａｓｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｂｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｓｕｎｉｖｅｒｓａｌｖａｃｃｉｎｅｔｈａｔｃａｎｐｒｏｔｅｃｔａｇａｉｎｓｔＨ９ＡＩＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀Ｈ９ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａꎻＨＡ１０９１ｇｅｎｅꎻｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍꎻｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅｓꎻｉｍｍｕｎｉｔｙ㊀㊀中国于１９９４年在广东分离出第一个Ｈ９Ｎ２病毒ꎮ中国提供的数据中(全球共享所有流感数据倡议ꎬＧＩＳＡＩＤ)Ｈ９Ｎ２分离株超过７０％ꎮ最新的活禽市场监测结果显示ꎬ２０１４－２０２２年Ｈ９Ｎ２分离率持续居高不下ꎬＨ９Ｎ２亚型逐渐超越其他亚型ꎬ成为家禽中最主要的亚型ꎬ同时也成为养禽业的头号感染源[１￣２]ꎮ大多数感染Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ(亚型禽流感)的鸡不会直接死亡ꎬ从而保留了二次感染其他亚型流感病毒的机会ꎬ促进了病毒重组ꎮＨ９Ｎ２禽流感病毒作为 供体病毒 ꎬ为包括Ｈ３Ｎ８㊁Ｈ５Ｎ１㊁Ｈ７Ｎ９㊁Ｈ１０Ｎ８和Ｈ１０Ｎ３在内的各种病毒亚型提供多个内部基因[３￣６]ꎮＨ９Ｎ２ＡＩＶ继续传播和进化将进一步增加它作为新ＡＩＶ基因供体的风险ꎮ尽管Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ对禽类的致病性不强ꎬ但当与家禽中的其他病原体发生共感染或继发感染时ꎬ会造成重大经济损失[７￣９]ꎮ１９９８年ꎬ中国广东报道了世界首例人类感染Ｈ９Ｎ２禽流感病毒的病例[１０]ꎮ截至２０２１年１２月ꎬ在全球报告中ꎬ人类感染Ｈ９Ｎ２禽流感病毒确诊病例已达９５例ꎬ其中２０２０－２０２１年报道的３３例病例中有３２例来自中国ꎬ证实了Ｈ９Ｎ２禽流感病毒存在宿主溢出的高风险[１１]ꎮ可见Ｈ９Ｎ２不仅给家禽业造成严重的经济损失ꎬ也对人类健康构成重大的威胁ꎬ是重要的人兽共患病病毒ꎮＨ９型ＡＩＶ与Ｈ５㊁Ｈ７型高致病性禽流感的控制策略不同ꎮ虽然没有强制接种Ｈ９Ｎ２禽流感疫苗ꎬ但几乎所有鸡群都接种了Ｈ９疫苗ꎬ以减少潜在的经济损失ꎮ中国兽药基本信息数据库数据表明ꎬ在过去５年中ꎬ全国大约有５０家生物公司生产了单价或多价Ｈ９Ｎ２疫苗ꎮ经认证的Ｈ９疫苗相关产品中ꎬ疫苗株多达２５株ꎬ且均为全病毒灭活疫苗ꎮ研究和临床数据表明ꎬ接种Ｈ９Ｎ２疫苗可以减少病毒感染引起的临床症状ꎬ为免疫鸡群提供有效保护ꎮ然而ꎬＨ９Ｎ２频繁的抗原漂移是当前Ｈ９Ｎ２疫苗接种的挑战之一ꎮ当Ｈ９Ｎ２疫苗毒株与流行毒株之间的抗原性存在差异时ꎬ全病毒灭活疫苗无法提供足够的保护[１２]ꎮＨ９Ｎ２疫苗需要优化毒株以适应当前病毒变异㊁多抗原群共流行的情况ꎮ重要的是ꎬＨ９Ｎ２灭活疫苗主要诱导体液免疫ꎬ难以阻断鸡上呼吸道的病毒感染和排毒ꎮＨ９Ｎ２ＡＩＶ能够有效地在鸡与鸡之间进行气溶胶传播ꎬ即使在接种疫苗的鸡之间也是如此[１３]ꎬ加大了病毒防控难度ꎮ因此ꎬ 防排毒 成为Ｈ９Ｎ２新型疫苗研制的新标准和又一挑战ꎮ目前迫切需要开发更高效的疫苗来防控Ｈ９Ｎ２ꎬ例如在细胞和黏膜免疫水平上改进现有疫苗ꎬ或开发广谱疫苗以应对抗原的频繁变异[１４]ꎮ本研究室拟通过对Ｈ５亚型ＡＩＶ的血凝素(ＨＡ)蛋白质序列进行比对分析ꎬ设计出ＨＡ共有序列ꎬ制备成ＨＡ亚单位疫苗ꎬ效力试验结果证明ꎬＨＡ亚单位疫苗对不同流行毒株具有理想的保护效果[１５￣１６]ꎮ基于以上研究成果ꎬ本研究同样选择具有免疫原性的ＨＡ基因ꎬ通过对２０１０－２０１９年Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ蛋白关键性氨基酸位点进行分析和统计ꎬ选择每个位点最高频率氨基酸序列ꎬ并对关键性抗原位点进行校正ꎬ设计出ＨＡ(Ｈ９亚型)共有序列[１６]ꎬ利用杆状病毒表达系统表达ＨＡ蛋白ꎮ免疫效力试验结果表明ꎬ该疫苗具有良好的㊁广谱的免疫效果ꎬ为后续广谱疫苗的研究提供了研究数据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料本实验室于２０１７－２０１９年在浙江㊁安徽㊁江苏和山东等省份的养鸡场分离筛选Ｈ９亚型ＡＩＶ毒株１１５㊁２３６㊁ＹＺꎬ经进化树分析ꎬ３个毒株属于ｈ９.４.２.５分支的不同亚分支ꎮＨ９亚型禽流感代表性毒株[Ａ/ｃｈｉｃｋｅｎ/Ｓｈａｎｄｏｎｇ/６/１９９６(ｈ９.４.２.３)(ＳＤ/６)㊁Ａ/ｃｈｉｃｋｅｎ/Ｇｕａｎ￣ｇｘｉ/５５/２００５(ｈ９.４.２.５)(ＧＸ/５５)㊁Ａ/ｔｕｒｋｅｙ/Ｗｉｓｃｏｎｓｏｎ/１/１９６６(ｈ９.１)(ＷＩ/１)]由南京农业大学平继辉教授惠赠ꎮ杆状病毒表达系统为本实验室保存ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀目的基因的设计㊀对２０１０－２０１９年公布的Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ蛋白的抗原相关位点㊁受体结合位点㊁潜在糖基化位点等关键序列进行分析ꎬ结合本试验室分离的Ｈ９流行株关键性氨基酸位点ꎬ利用生物信息学软件选择高频氨基酸ꎬ并对关键性位点进行校正ꎬ设计合成基因ＨＡꎮ１.２.２㊀重组杆状病毒的获得与鉴定㊀利用杆状病毒表达系统构建和制备含有目的基因ＨＡ的重组杆状病毒ꎬ经蓝白斑筛选获得含有ＨＡ基因的重组质粒ꎮ用ＨＡ重组质粒转染Ｓｆ９细胞ꎬ２７ħ静置培养ꎬ每天观察ꎬ待转染细胞出现停止生长㊁变圆㊁脱落等细胞病变２０９１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第９期症状时ꎬ收获ꎬ得到重组杆状病毒ｒＶＨＡꎮ提取ｒＶＨＡ基因组ＤＮＡꎬ然后进行ＰＣＲ鉴定ꎮＰＣＲ鉴定正确后ꎬ取重组病毒ｒＶＨＡ上清液接种Ｓｆ９细胞ꎬ观察４ｄꎬ固定细胞ꎬ进行间接免疫荧光鉴定重组病毒特异性ꎮ１.２.３㊀重组蛋白的表达㊁分析㊀取重组杆状病毒ｒＶＨＡ上清液ꎬ接种悬浮培养的ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞ꎬ同时将野生型杆状病毒感染ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞作为对照ꎮ每天取少量细胞液进行台盼蓝染色ꎬ观察细胞死亡情况ꎬ待细胞９０％变蓝后收获ꎬ利用高压均质机将细胞破碎ꎬ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ￣Ｂｌｏｔ㊁血凝活性等分析ꎮ１.２.４㊀红细胞凝集试验检测重组蛋白ＨＡ血凝活性㊀在微量血凝板上先加２５μｌ磷酸缓冲盐溶液(ＰＢＳ)ꎻ第一孔加２５μｌ重组蛋白(ｒＨＡ)混匀ꎬ倍比稀释至２１６ꎻ每孔再加入２５μｌＰＢＳ㊁２５μｌ１％鸡红细胞悬液ꎬ室温(２０~２５ħ)下反应３０ｍｉｎꎬ记录结果ꎮ１.２.５㊀重组杆状病毒传代后遗传稳定性及增殖性能鉴定㊀将重组杆状病毒ｒＶＨＡ连续传代至第８代ꎬ对每代ＨＡ基因的核酸序列进行测序ꎮ对每代重组杆状病毒进行病毒滴度(ＴＣＩＤ５０)鉴定ꎬ评价重组杆状病毒的增殖性能ꎮ１.２.６㊀交叉血凝抑制试验(ＨＩ)㊀检测ｒＨＡ与不同分支Ｈ９亚型ＡＩＶ病毒阳性血清(１１５㊁２３６㊁ＹＺ㊁ＳＤ/６㊁ＷＩ/１)的交叉反应活性ꎬ设无特定病原(ＳＰＦ)阴性血清为对照ꎮ１.２.７㊀重组蛋白的免疫原性评价㊀重组蛋白ｒＨＡ与白油按体积比１ʒ３乳化制备成ＨＡ油乳剂疫苗ꎮ乳化完全后ꎬ经性状㊁稳定性和无菌检验后ꎬ无菌装入疫苗瓶内ꎬ命名为ｒＨＡ疫苗ꎬ４ħ保存ꎮ１０日龄ＳＰＦ鸡３０只ꎬ分３组ꎬ每组１０只鸡ꎮ第一组ꎬｒＨＡ疫苗组ꎬ颈部皮下注射ｒＨＡ疫苗ꎬ每只注射０ ５ｍｌꎻ第二组ꎬ商品疫苗组ꎬ每只注射０ ３ｍｌꎻ第三组ꎬ阴性对照组ꎬ每只注射０ ５ｍｌ无菌生理盐水ꎮ免疫后第１４ｄ㊁２１ｄ㊁２８ｄ采血ꎬ分离血清ꎬ检测血清ＨＩ抗体效价ꎮ免疫２８ｄ后ꎬ选取２株处于不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ流行毒株１１５和ＹＺ株进行攻毒ꎬ每只攻毒剂量为１ˑ１０６ ０ＥＩＤ５０(半数鸡胚感染量)ꎮ每日观察鸡群采食量㊁饮水量以及精神状态是否出现异常ꎬ观察是否出现发病和死亡情况ꎮ攻毒后２ｄ㊁４ｄ㊁６ｄ㊁８ｄ㊁１０ｄ㊁１２ｄ㊁１４ｄ称量各组试验鸡的质量ꎬ计算鸡的相对增质量率ꎮ攻毒后３ｄ㊁５ｄ㊁７ｄ用无菌棉拭子采集鸡喉头和泄殖腔分泌物ꎬ采集的拭子样品通过尿囊腔途径接种１０日龄ＳＰＦ鸡胚３枚ꎬ每枚０ ２ｍｌꎬ每天观察ꎬ连续观察５日ꎬ检测鸡胚尿囊液血凝效价ꎮ若接种喉拭子或泄殖腔拭子的鸡胚任何一个出现鸡胚尿囊液血凝效价ȡ１ˑ２２ꎬ则该鸡排毒ꎻ若鸡胚尿囊液血凝效价<１ˑ２２则为可疑ꎬ需要盲传一代ꎬ盲传后血凝效价<１ˑ２２则判定为阴性ꎬ表明该鸡不排毒ꎮ１.３㊀数据处理用Ｒｅｅｄ￣Ｍｕｅｎｃｈ法计算病毒滴度ꎮ用Ｇｒａｐｈ￣ＰａｄＰｒｉｓｍ５软件进行统计学分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀重组质粒的鉴定对构建的ｐＦａｓｔＢａｃ１￣ＨＡ重组杆状病毒转移质粒进行双酶切验证ꎬ获得目的基因和载体２个条带(图１)ꎬ结果表明ＨＡ基因与载体ｐＦａｓｔＢａｃ１连接成功ꎮＭ:ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒꎻ１:双酶切重组质粒ꎮ图１㊀重组质粒ｐＦａｓｔＢａｃ１￣ＨＡ的鉴定Ｆｉｇ.１㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＦａｓｔＢａｃ１￣ＨＡ２.２㊀重组病毒的拯救与鉴定用重组质粒转染Ｓｆ９细胞ꎬ细胞变大变圆ꎬ折光率增加ꎬ细胞停止生长ꎬ表明细胞出现病变ꎬ收获为ｒＶＨＡꎮ通过间接免疫荧光检测重组病毒ｒＶＨＡ感染的细胞与不同Ｈ９阳性血清反应的情况ꎬ荧光显微镜下可见ꎬ感染重组病毒的细胞出现明亮的绿色荧光(图２Ａ~图２Ｃ)ꎻ野生型杆状病毒感染细胞未出现明显荧光(图２Ｄ)ꎬ表明含ＨＡ基因的重组杆状病毒拯救成功ꎬ且表达的ＨＡ蛋白与不同Ｈ９阳性血清间有反应活性ꎮ２.３㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定重组蛋白的表达ｒＶＨＡ感染的ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞完全病变后收获ꎬ用高压均质机裂解细胞ꎬ然后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ￣Ｂｌｏｔ鉴定ꎬｒＨＡ与Ｈ９亚型ＡＩＶ阳性血清孵育后ꎬ出现与预期大小一致㊁较明显的特异条带６３０００(图３)ꎬ证明ＨＡ蛋白成功获得大量表达ꎮ３０９１张雪花等:Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力Ａ:ｒＶＨＡ感染Ｓｆ９细胞(１１５血清)ꎻＢ:ｒＶＨＡ感染Ｓｆ９细胞(ＳＤ/６血清)ꎻＣ:ｒＶＨＡ感染Ｓｆ９细胞(ＷＩ/１)ꎻＤ:野毒感染Ｓｆ９细胞(１１５血清)ꎮ图２㊀重组蛋白ＨＡ与不同Ｈ９亚型禽流感阳性血清结合的间接免疫荧光法鉴定Ｆｉｇ.２㊀Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅ￣ｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＨＡｒｅａｃｔｉｎｇｗｉｔｈｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｏｆｄｉｆ￣ｆｅｒｅｎｔＨ９ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｓｕｂｔｙｐｅｓＭ:蛋白ｍａｒｋｅｒꎻ１:重组蛋白ＨＡꎻ２:野生杆状病毒对照ꎮ图３㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析重组蛋白质与Ｈ９阳性血清的反应Ｆｉｇ.３㊀ＲｅａｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｏｆＨ９ｓｕｂｔｙｐｅｓａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ２.４㊀重组蛋白ＨＡ血凝活性通过微量血凝试验检测ｒＨＡ血凝活性ꎬ同时设１１５病毒尿囊液为对照ꎬ表达的重组蛋白ＨＡ血凝效价为１ˑ２１２(图４)ꎬ说明ｒＨＡ具有凝集红细胞的生物学活性ꎮ２.５㊀重组病毒遗传稳定性及增殖性能鉴定测序结果显示ꎬ第１~８代重组杆状病毒的外源ＨＡ基因与目的序列完全一致ꎬ表明重组病毒具有良好的遗传稳定性ꎮ重组杆状病毒传至第７~８代时病毒滴度达１０８.００ＴＣＩＤ５０/ｍｌ以上(表１)ꎬ表明重组杆状病毒增殖性能良好ꎮ图４㊀重组ＨＡ蛋白的血凝活性检测Ｆｉｇ.４㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨＡｐｒｏｔｅｉｎ表１㊀重组杆状病毒稳定性检测结果Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ毒种代次ＴＣＩＤ５０的对数Ｐ３６.００Ｐ４６.５０Ｐ５７.２５Ｐ６７.５０Ｐ７８.５０Ｐ８８.２５ＴＣＩＤ５０:病毒滴度ꎮ２.６㊀重组ＨＡ蛋白交叉反应活性通过ＨＩ试验测定ｒＨＡ与不同分支Ｈ９阳性血清交叉反应的抗原性ꎬ并同时与不同分支Ｈ９病毒进行比较ꎮ由图５可知ꎬｒＨＡ与现有流行毒株血清(ｈ９.４.２.５)反应的ＨＩ滴度较高ꎬ与分支较远的ＷＩ/１(ｈ９.１)反应最差ꎮ除去血清与同源病毒的反应ꎬｒＨＡ反应活性明显优于其他病毒ꎬ表明ｒＨＡ具有良好的交叉反应活性ꎮ２.７㊀重组病毒的免疫原性评价ＨＩ血清抗体作为流感疫苗血清学保护的反应指标ꎬ商品疫苗效力评判标准为ＨＩ抗体效价ȡ１ˑ２６.００ꎮ试验组于免疫后１４ｄ㊁２１ｄ㊁２８ｄ采集静脉血ꎬ以分离的流行毒株１１５㊁ＹＺ作为检测抗原检测血清抗体ＨＩ效价ꎮ重组蛋白疫苗免疫后１４ｄ即可诱导鸡产生较高水平的ＨＩ抗体应答ꎬ免疫后１４ｄＨＩ效４０９１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第９期价能达到１ˑ２１２.００以上ꎬ免疫后２８ｄ达到１ˑ２１４.５９ꎬｒＨＡ组抗体效价显著高于商品苗组(图６)ꎮ㊀㊀ＳＰＦ鸡免疫２８ｄ后ꎬ对不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ流行株１１５和ＹＺ以１ˑ１０６ＥＩＤ５０的病毒量进行攻毒ꎮ临床观察结果显示ꎬ各攻毒试验组在攻毒后１４ｄ内均无死亡ꎮｒＨＡ组㊁商品苗组在攻毒后无异常ꎬ饮水量㊁采食量㊁精神状态均正常ꎬ空白组(阴性组)在攻毒后４ｄ食欲与饮水欲相对较差ꎮ攻毒后２ｄ㊁４ｄ㊁６ｄ㊁８ｄ㊁１０ｄ㊁１２ｄ㊁１４ｄ分别对各组试验鸡称体质量ꎬ并计算不同试验组鸡体质量相对增长率ꎮ结果显示ꎬｒＨＡ免疫组的试验鸡相对增质量率最高ꎻ空白组(阴性组)的鸡相对增质量率明显低于免疫组(图７)ꎮａ:ｒＨＡꎻｂ:ｈ９.４.２.５￣１１５ꎻｃ:ｈ９.４.２.５￣２３６ꎻｄ:ｈ９.４.２.５￣ＹＺꎻｅ:Ｓｈ９.４.２.３￣ＳＤ/６ꎻｆ:ｈ９.１￣ＷＩ/１ꎮｈ９.４.２.５为流行毒株ꎮ图５㊀重组蛋白ＨＡ与Ｈ９不同阳性血清型交叉反应活性Ｆｉｇ.５㊀Ｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＨＡｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒ￣ｅｎｔｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒｏｔｙｐｅｓｏｆＨ９Ａ:以病毒１１５为检测抗原检测免疫后血清ＨＩ抗体ꎻＢ:以病毒ＹＺ为检测抗原检测免疫后血清ＨＩ抗体ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎮ图６㊀不同抗原检测免疫后血清ＨＩ抗体Ｆｉｇ.６㊀ＨＩａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｓｅｒａａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｓＡ:感染１１５毒株后试验鸡相对增质量率ꎻＢ:感染ＹＺ毒株后试验鸡相对增质量率ꎮ图７㊀攻毒后不同试验组鸡的相对增质量率Ｆｉｇ.７㊀Ｒｅｌａｔｉｖｅｗｅｉｇｈｔｇａｉｎｒａｔｅｏｆｃｈｉｃｋｅｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓａｆｔｅｒｃｈａｌｌｅｎｇｅ㊀㊀１１５和ＹＺ毒株感染后３ｄ㊁５ｄ㊁７ｄ分别采集各组试验鸡的咽拭子和泄殖腔拭子样品ꎬ测定攻毒后每只鸡的排毒情况ꎮ感染１１５毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组喉头排毒率为２０％ꎬ泄殖腔排毒率为０ꎻ感染５ｄ后ꎬ喉头排毒率为２０％ꎬ泄殖腔排毒率为０ꎻ商品苗感染３ｄ后ꎬ喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率为２０％ꎻ感染５ｄ后ꎬ喉头排毒率为２０％ꎬ泄殖腔未检测到排毒ꎻ阴性对照组感染３ｄ㊁５ｄ后ꎬ喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率为１００％ꎻ感染７ｄ后所有组未测到排毒(表２)ꎮ５０９１张雪花等:Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力表２㊀感染１１５毒株免疫保护结果Ｔａｂｌｅ２㊀Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔ１１５ｓｔｒａｉｎｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ组别㊀㊀喉头排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄ泄殖腔排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄｒＨＡ组２０２０００００商品苗组１００２００２０００阴性对照组１００１０００１００１０００㊀㊀攻击ＹＺ毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组的喉头排毒率为２０％ꎻ其余未检测到病毒ꎬ排毒率为０ꎮ商品苗组攻毒３ｄ后的喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率为２０％ꎻ攻毒５ｄ后喉头排毒率为４０％ꎬ泄殖腔未检测到排毒ꎮ阴性对照组攻毒３ｄ㊁５ｄ后的喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率也为１００％ꎮ７ｄ后所有组未测到排毒(表３)ꎮ综上ꎬｒＨＡ疫苗组保护率明显高于商品苗组ꎬ表明ｒＨＡ疫苗对当前Ｈ９亚型ＡＩＶ流行株毒株具有良好的保护效果ꎮ表３㊀感染ＹＺ毒株免疫保护结果Ｔａｂｌｅ３㊀ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＹＺｓｔｒａｉｎｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ组别㊀㊀喉头排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄ泄殖腔排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄｒＨＡ组２００００００商品苗组１００４００２０００阴性对照组１００１０００１００１０００３㊀讨论目前ꎬ中国控制Ｈ９Ｎ２禽流感的主要策略是疫苗接种ꎮ然而ꎬ中国Ｈ９Ｎ２病毒多种抗原型同时流行ꎬ疫苗更新速度落后于病毒变异速度ꎬ使有效疫苗接种面临挑战ꎮ灭活疫苗免疫可有效减轻Ｈ９Ｎ２病毒感染后的临床症状ꎬ大大减少经济损失ꎮ然而ꎬ另一个挑战是全病毒灭活疫苗免疫不能阻止Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ再感染或病毒脱落ꎮ在中国ꎬ包括散养和混养在内的传统畜牧业系统继续占据重要地位ꎬ然而ꎬ中国家禽业的主要发展方向是集约化圈养ꎮ研制具有广谱性中和活性的通用疫苗对于控制Ｈ９Ｎ２具有重要意义ꎮ关于广谱疫苗的研究已有报道ꎬ利用Ｅｐｉｇｒａｐｈ算法来设计猪Ｈ３流感疫苗血凝素蛋白ꎬ该疫苗接种小鼠后可产生显著针对不同Ｈ３分离株的交叉反应抗体和Ｔ细胞反应ꎬ免疫雪貂后ꎬ用２种Ｈ３Ｎ２病毒攻击ꎬ该疫苗可保护雪貂免受攻击毒株的侵害[１７￣１８]ꎻ基于马赛克ＨＡ序列的Ｈ９亚型禽流感灭活疫苗能对异源Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ株产生较好的交叉攻毒保护效果[１９]ꎮ随着基因工程技术的发展ꎬ重组病毒表达系统成为生产有广谱交叉免疫效果的禽流感疫苗的技术平台ꎮ杆状病毒表达系统具有诸多优点:不使用活病毒ꎬ生物安全性高ꎻ表达的ＨＡ蛋白可组装成病毒样颗粒(ＶＬＰ)ꎬ其结构功能与天然蛋白质相似ꎬ免疫原性良好ꎬ蛋白质表达效率高ꎻ重组杆状病毒基因遗传稳定ꎬ病毒增殖性能良好ꎬ保证了疫苗的生产质量[２０￣２１]ꎮ新型广谱疫苗一直是防控禽流感病毒相关研究的热点方向ꎬ只研究单个毒株的ＨＡ免疫原性ꎬ不能得到具有广谱保护效果的疫苗ꎬ本研究通过对２０１０－２０１９年Ｈ９亚型禽流感及本试验室分离的最新流行株ＨＡ蛋白的抗原相关位点㊁受体结合位点㊁潜在糖基化位点等关键位点序列进行分析ꎬ并对关键位点进行校正ꎬ利用生物信息学软件选择每个位点最高频次氨基酸设计合成ＨＡ基因ꎬ并构建杆状病毒表达系统获得重组蛋白ꎬ经间接免疫荧光㊁免疫印迹㊁交叉血凝抑制试验对其广谱活性进行鉴定ꎬ初步证明重组蛋白具有广谱的交叉反应活性ꎮ重组蛋白疫苗免疫后１４ｄ即可诱导鸡产生较高水平的ＨＩ抗体应答ꎬ１４ｄＨＩ效价能达到２１２.００以６０９１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第９期上ꎬ２８ｄ达到１ˑ２１４.５９ꎬ显著高于商品苗组ꎮ用２株不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ毒株１１５㊁ＹＺ攻击免疫组鸡ꎬ各组均未出现临床症状ꎮ攻击１１５毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为８０％ꎬ商品苗保护率为０ꎻ５ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为８０％ꎬ商品苗保护率为８０％ꎮ攻击ＹＺ毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为８０％ꎬ商品苗保护率为０ꎻ５ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为１００％ꎬ商品苗保护率为６０％ꎮ表明ꎬ重组蛋白疫苗组产生较好的交叉保护效果ꎬ明显高于商品苗组ꎮ另外ꎬ本研究采用高表达效率的ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞ꎬ提高了蛋白质的表达量ꎬ血凝活性高达１ˑ２１２ꎻｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞为无血清培养基培养的全悬浮细胞ꎬ降低了成本ꎬ生产周期变短ꎬ适于大规模培养ꎬ为亚单位疫苗规模化生产提供了可行性ꎮ综上ꎬ通过分析㊁设计Ｈ９亚型禽流感ＨＡ关键位点等得到ＨＡ基因ꎬ利用Ｂａｃ￣ｔｏ￣Ｂａｃ表达的外源蛋白ＨＡ具有广谱的保护效力ꎬ可为研究Ｈ９亚型广谱亚单位疫苗提供技术基础和科学依据ꎮ参考文献:[１]㊀ＢＩＹＨꎬＣＨＥＮＱＪꎬＷＡＮＧＱＬꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｅｓｉｓꎬｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆＨ５Ｎ６ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＣｅｌｌＨｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅꎬ２０１６ꎬ２０(６):８１０￣８２１.[２]㊀ＢＩＹＨꎬＬＩＪꎬＬＩＳＱꎬｅｔａｌ.Ｄｏｍｉｎａｎｔｓｕｂｔｙｐｅｓｗｉｔｃｈｉｎａｖｉａｎｉｎ￣ｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｄｕｒｉｎｇ２０１６－２０１９ｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉ￣ｃａｔｉｏｎｓꎬ２０２０ꎬ１１(１):５９０９.[３]㊀ＰＵＪꎬＷＡＮＧＳＧꎬＹＩＮＹＢꎬｅｔａｌ.ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕ￣ｅｎｚａｇｅｎｏｔｙｐｅｔｈａｔｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄｔｈｅｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅｎｏｖｅｌＨ７Ｎ９ｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔ￣ｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１５ꎬ１１２:５４８￣５５３.[４]㊀ＧＵＡＮＹꎬＳＨＯＲＴＲＩＤＧＥＫＦꎬＫＲＡＵＳＳＳꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒ￣ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ:ｗｅｒｅｔｈｅｙｔｈｅｄｏｎｏｒｓｏｆｔｈｅ"ｉｎｔｅｒｎａｌ"ｇｅｎｅｓｏｆＨ５Ｎ１ｖｉｒｕｓｅｓｉｎＨｏｎｇＫｏｎｇ?[Ｊ].Ｐｒｏｃｅｅｄ￣ｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡ￣ｍｅｒｉｃａꎬ１９９９ꎬ９６(１６):９３６３￣９３６７.[５]㊀ＱＩＷꎬＺＨＯＵＸꎬＳＨＩＷꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅｎｏｖｅｌｈｕｍａｎ￣ｉｎｆｅｃ￣ｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ(Ｈ１０Ｎ８)ｖｉｒｕｓａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｉｎｐｏｕｌｔｒｙꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅꎬ２０１４ꎬ１９(２５):２０８４１.[６]㊀ＬＩＦＴꎬＬＩＵＪＹꎬＹＡＮＧＪＺꎬｅｔａｌ.Ｈ９Ｎ２ｖｉｒｕｓ￣ｄｅｒｉｖｅｄＭ１ｐｒｏ￣ｔｅｉｎｐｒｏｍｏｔｅｓＨ５Ｎ６ｖｉｒｕｓｒｅｌｅａｓｅｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ:ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｔｅｒ￣ｓｐｅｃｉｅｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０２１ꎬ１７(１２):ｅ１０１００９８.[７]㊀ＬＩＣＪꎬＹＵＫＺꎬＴＩＡＮＧＢꎬｅｔａｌ.ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉ￣ｒｕｓｅｓｆｒｏｍｄｏｍｅｓｔｉｃｐｏｕｌｔｒｙｉｎｍａｉｎｌａｎｄＣｈｉｎａ[Ｊ].ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒ￣ｎａｌꎬ２００５ꎬ３４０(１):７０￣８３.[８]㊀ＣＨＯＩＹＫꎬＯＺＡＫＩＨꎬＷＥＢＢＹＲＪꎬｅｔａｌ.ＣｏｎｔｉｎｕｉｎｇｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌ￣ｏｇｙꎬ２００４ꎬ７８(１６):８６０９￣８６１４.[９]㊀ＧＵＯＹＪꎬＫＲＡＵＳＳＳꎬＳＥＮＮＥＤＡꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｎｅｗｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｌｉｎｅａｇｅｓｉｎＡｓｉａ[Ｊ].ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０００ꎬ２６７(２):２７９￣２８８.[１０]郭元吉ꎬ李建国ꎬ程小雯ꎬ等.禽Ｈ９Ｎ２亚型流感病毒能感染人的发现[Ｊ].中华实验和临床病毒学杂志ꎬ１９９９ꎬ１３(２):５￣８. [１１]ＡＤＬＨＯＣＨＣꎬＦＵＳＡＲＯＡꎬＧＯＮＺＡＬＥＳＪＬꎬｅｔａｌ.Ａｖｉａｎｉｎｆｌｕ￣ｅｎｚａｏｖｅｒｖｉｅｗＳｅｐｔｅｍｂｅｒ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２１[Ｊ].ＥＦＳＡＪｏｕｒｎａｌꎬ２０２１ꎬ１９(１２):ｅ０７１０８.[１２]ＳＵＮＹＰꎬＰＵＪꎬＦＡＮＬＨꎬｅｔａｌ.Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉ￣ｆｉｃａｃｙｏｆａｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｉｃｇｒｏｕｐｓｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ１５６(１/２):１９３￣１９９.[１３]ＺＨＯＮＧＬꎬＷＡＮＧＸＱꎬＬＩＱＨꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅａｉｒｂｏｒｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆＨ９Ｎ２ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ８８(１７):９５６８￣９５７８. [１４]ＤＯＮＧＪＺꎬＺＨＯＵＹꎬＬＩＵＬＴꎬｅｔａｌ.ＳｔａｔｕｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｆｏｒｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔａｖｉａｎＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｌｉｆｅ￣ｂａｓｅｌꎬ２０２２ꎬ１２(９):１３２６.[１５]ＷＵＰＰꎬＬＵＪＨꎬＺＨＡＮＧＸＨꎬｅｔａｌ.Ｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｏｆｃｏｎｓｅｎｓｕｓｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ￣ｂａｓｅｄｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓｃｈｉｃｋｅｎｓａｇａｉｎｓｔｄｉｖｅｒｇｅｎｔＨ５ｓｕｂｔｙｐｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩｍ￣ｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ８:１６４９.[１６]张雪花ꎬ陆吉虎ꎬ华㊀涛ꎬ等.通用型Ｈ５亚型禽流感病毒亚单位疫苗抗原表达和免疫效力研究[Ｊ].病毒学报ꎬ２０１９ꎬ３５(６):８６４￣８７２.[１７]ＢＵＬＬＡＲＤＢＬꎬＣＯＥＤＥＲＢＮꎬＤＥＢＥＡＵＣＨＡＭＰＪꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉ￣ｇｒａｐｈｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｓｂｒｏａｄｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙａｇａｉｎｓｔｓｗｉｎｅＨ３ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎꎬ２０２１ꎬ１２(１):１２０３.[１８]ＢＵＬＬＡＲＤＢＬꎬＤＥＢＥＡＵＣＨＡＭＰＪꎬＰＥＫＡＲＥＫＭＪꎬｅｔａｌ.Ａｎｅｐｉｔｏｐｅ￣ｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｕｍａｎＨ３Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｓｂｒｏａｄＬＹｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｍｉｃｅａｎｄｆｅｒｒｅｔｓ[Ｊ].ＮＰＪＶａｃｃｉｎｅｓꎬ２０２２ꎬ７(１):６５.[１９]李㊀丽ꎬ唐国毅ꎬ冯贺龙ꎬ等.基于马赛克ＨＡ序列的Ｈ９亚型禽流感灭活疫苗的免疫效力分析[Ｊ].畜牧兽医学报ꎬ２０２１ꎬ５２(１２):３５６９￣３５７７.[２０]ＢＵＣＫＬＡＮＤＢꎬＢＯＵＬＡＮＧＥＲＲꎬＦＩＮＯＭꎬｅｔａｌ.Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｓｃａｌｅ￣ｕｐｏｆｔｈｅＦｌｕｂｌｏｋｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ(ＨＡ)ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓꎬ２０１４ꎬ３２(４２):５４９６￣５５０２.[２１]ＭＡＮＮＩＮＩＩꎬＴＲＯＭＢＥＴＴＡＭꎬＬＡＺＺＥＲＩＧꎬｅｔａｌ.Ｅｇｇ￣ｉｎｄｅｐｅｎｄ￣ｅｎｔｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｃａｎｄｉｄａｔｅｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓ(Ｂａ￣ｓｅｌ)ꎬ２０１７ꎬ５(３):１８.(责任编辑:陈海霞)７０９１张雪花等:Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力。