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一、实验目的1. 了解固定化酶的概念、原理及其在生物催化领域的应用。
2. 掌握固定化酶的制备方法，提高实验操作技能。
3. 通过实验，了解固定化酶的催化活性、稳定性及重用性能。
二、实验原理固定化酶是指通过物理或化学方法将酶固定在固体载体上，使其在催化反应中保持酶活性的一种技术。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长使用寿命；2. 方便酶的回收和重复利用；3. 易于控制反应条件，提高催化效率。
固定化酶的制备方法主要有吸附法、包埋法和结合法。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、酶、底物、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、烘箱、恒温水浴锅、显微镜、酶标仪等。
四、实验步骤1. 吸附法固定化酶（1）将纤维素或琼脂糖溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与纤维素或琼脂糖溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
2. 包埋法固定化酶（1）将聚丙烯酰胺溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与聚丙烯酰胺溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
3. 结合法固定化酶（1）将酶蛋白分子与不溶性固相支持物（如离子交换树脂）进行离子键结合。
（2）将结合后的酶蛋白分子与底物反应，观察催化效果。
五、实验结果与分析1. 吸附法固定化酶：通过吸附法固定化酶，酶的活性保持较好，但固定化酶的稳定性较差，易受外界环境因素影响。
2. 包埋法固定化酶：通过包埋法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，但固定化酶的催化效率较低。
3. 结合法固定化酶：通过结合法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，且催化效率较高。
六、实验结论1. 固定化酶的制备方法有吸附法、包埋法和结合法，各方法有其优缺点。
《酶的制备及活力测定》作业设计方案一、作业目标1、让学生了解酶的制备方法和原理，掌握常见酶的提取和纯化流程。
2、使学生学会运用不同的方法测定酶的活力，理解酶活力的概念和测定意义。
3、培养学生的实验操作技能和科学思维能力，提高学生分析和解决问题的能力。
4、增强学生对生物化学这门学科的兴趣，培养学生严谨的科学态度和团队合作精神。
二、作业内容（一）酶的制备1、选择合适的酶源要求学生查阅资料，选择一种感兴趣的酶，并说明选择该酶的原因。
列举常见的酶源，如动物组织、植物组织、微生物等，并分析它们的优缺点。
2、酶的提取描述酶提取的基本原理和方法，如匀浆法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。
让学生设计实验方案，从选定的酶源中提取酶，并记录实验步骤和注意事项。
3、酶的纯化介绍酶纯化的常用方法，如层析法、超滤法、电泳法等。
要求学生根据提取得到的酶粗提液，选择合适的纯化方法进行纯化，并分析纯化效果。
（二）酶活力测定1、酶活力的概念和单位解释酶活力的定义，即酶催化一定化学反应的能力。
介绍常见的酶活力单位，如国际单位（IU）、 Katal 单位等，并说明它们的换算关系。
2、酶活力测定方法列举常见的酶活力测定方法，如分光光度法、荧光法、电化学法等。
让学生选择一种测定方法，测定所制备酶的活力，并记录实验数据和结果。
3、影响酶活力的因素分析影响酶活力的因素，如温度、pH 值、底物浓度、抑制剂等。
设计实验，探究其中一个因素对酶活力的影响，并绘制曲线进行分析。
三、作业形式1、实验报告要求学生撰写实验报告，包括实验目的、原理、材料与方法、结果与分析、讨论等部分。
实验报告应书写规范、条理清晰、数据准确、图表规范。
2、小组汇报学生分组进行实验，每组选择一名代表进行汇报，汇报内容包括实验过程、结果、遇到的问题及解决方法等。
其他小组可以进行提问和讨论，教师进行点评和总结。
3、在线测试设计在线测试题目，考查学生对酶的制备和活力测定相关知识的掌握程度。
一、实验目的1. 了解酶活性测定的原理和方法。
2. 掌握酶活性测定的操作步骤。
3. 学会分析实验结果，了解酶活性受温度、pH值等因素的影响。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的进行。
酶活性是指酶催化特定反应的能力，通常以单位时间内底物消耗量或产物生成量来表示。
本实验采用比色法测定酶活性，通过测定酶催化反应产物的生成量来间接反映酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 仪器：紫外分光光度计、恒温水浴、电子天平、移液器、试管等。
2. 试剂：淀粉酶、淀粉溶液、碘液、NaOH溶液、HCl溶液等。
3. 材料：新鲜土豆、苹果、黄瓜等。
四、实验步骤1. 淀粉酶的提取- 称取新鲜土豆或苹果，切碎后加入适量的蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆过滤，取滤液备用。
2. 淀粉溶液的制备- 称取一定量的可溶性淀粉，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
- 将淀粉溶液煮沸，使其糊化，冷却后备用。
3. 酶活性测定- 取适量淀粉溶液，加入一定量的酶液，混合均匀。
- 将混合液放入恒温水浴中，保持一定温度。
- 定时取样，用碘液滴定，计算淀粉的剩余量。
- 根据淀粉的剩余量，计算酶活性。
4. 不同温度、pH值对酶活性的影响- 将淀粉溶液和酶液在不同温度、pH值下进行混合，观察酶活性变化。
五、实验结果与分析1. 酶活性测定结果- 根据实验结果，计算酶活性单位。
2. 不同温度、pH值对酶活性的影响- 在不同温度、pH值下，酶活性变化如下：- 温度：在适宜的温度范围内，酶活性随着温度的升高而增加，超过适宜温度后，酶活性逐渐降低。
- pH值：在适宜的pH值范围内，酶活性随着pH值的升高而增加，超过适宜pH值后，酶活性逐渐降低。
六、实验结论1. 酶活性是指酶催化特定反应的能力，可以通过比色法等方法进行测定。
2. 酶活性受温度、pH值等因素的影响，适宜的温度和pH值可以提高酶活性。
3. 本实验成功测定了淀粉酶的活性，并探讨了温度、pH值等因素对酶活性的影响。
一、实验目的1. 了解酶固定化的原理和方法。
2. 掌握酶固定化过程中的关键步骤。
3. 分析固定化酶的性能及其影响因素。
二、实验原理酶固定化是将酶固定在固体载体上，使其在反应过程中保持活性，便于重复使用。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长酶的使用寿命。
2. 降低酶的生产成本，提高生产效率。
3. 方便酶的分离和回收，减少环境污染。
三、实验材料1. 酶：青霉素酰化酶（PGA）2. 固定化载体：海藻酸钠、明胶、壳聚糖等3. 试剂：NaCl、CaCl2、HCl、NaOH、磷酸盐缓冲液等4. 仪器：恒温水浴、pH计、分光光度计、移液器、离心机等四、实验步骤1. 酶的活化将青霉素酰化酶溶于磷酸盐缓冲液，调节pH值为7.0，在37℃下活化30分钟。
2. 载体的准备将海藻酸钠、明胶、壳聚糖等载体分别溶解于磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为1%的溶液。
3. 酶的固定化将活化后的酶与载体溶液混合，搅拌混合均匀。
将混合液滴入CaCl2溶液中，使酶与载体形成凝胶珠。
4. 固定化酶的洗涤用磷酸盐缓冲液反复洗涤固定化酶凝胶珠，去除未固定的酶和杂质。
5. 固定化酶的活化将洗涤后的固定化酶凝胶珠放入磷酸盐缓冲液中，在37℃下活化30分钟。
6. 酶活性的测定采用比色法测定固定化酶的活性。
以青霉素G为底物，在37℃下反应30分钟，用紫外分光光度计测定反应液中的青霉素G浓度，计算酶活性。
7. 固定化酶的稳定性测试将固定化酶凝胶珠分别在不同温度、pH值、离子强度等条件下进行稳定性测试。
五、实验结果与分析1. 酶的固定化效果通过比色法测定，固定化酶的活性与游离酶活性相近，表明固定化过程未对酶活性产生显著影响。
2. 固定化酶的稳定性固定化酶在不同温度、pH值、离子强度等条件下均表现出良好的稳定性，表明固定化酶具有良好的耐温、耐酸碱、耐盐等性能。
3. 固定化酶的重复使用性固定化酶经过多次反应和洗涤后，仍保持较高的酶活性，表明固定化酶具有良好的重复使用性。
3.4 酶的固定化
固定化酶（immobilized enzyme）
不溶于水的酶。
是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。
酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。
便于运输和贮存，有利于自动化生产。
固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。
物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。
但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。
化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.
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《酶的制备及活力测定》作业设计方案一、作业目标通过本次作业，使学生深入理解酶的制备方法和活力测定的原理与技术，培养学生的实验操作能力、数据分析能力和科学思维能力。
二、作业内容1、酶的制备（1）查阅相关资料，了解常见酶（如蛋白酶、淀粉酶等）的来源和特性。
（2）选择一种酶，设计其制备方案，包括材料准备、实验步骤和注意事项。
（3）记录制备过程中的实验现象和遇到的问题，并进行分析和解决。
2、酶活力测定（1）学习酶活力测定的基本原理和常用方法（如比色法、分光光度法等）。
（2）根据所制备的酶，选择合适的活力测定方法，并设计实验方案。
（3）进行酶活力测定实验，记录实验数据。
3、结果分析与讨论（1）对酶活力测定的数据进行处理和分析，计算酶的活力值。
（2）讨论影响酶活力的因素，如温度、pH 值、底物浓度等，并分析实验结果与理论值的差异。
（3）提出改进实验方案的建议和想法。
三、作业要求1、学生以小组为单位完成作业，每组 3-5 人。
2、提交一份详细的作业报告，包括酶的制备方案、活力测定方案、实验数据和结果分析等内容。
3、作业报告应书写规范、条理清晰、数据准确、图表规范。
4、鼓励学生在作业中提出创新的想法和观点。
四、作业步骤1、分组与选题（1）教师根据学生的兴趣和能力，将学生分成若干小组。
（2）各小组选择一种酶作为研究对象，并确定作业的具体内容和目标。
2、资料查阅与方案设计（1）小组成员分工查阅相关资料，了解所选酶的性质和制备方法。
（2）共同讨论并设计酶的制备和活力测定方案，明确实验步骤、所需试剂和仪器设备等。
3、实验操作（1）按照设计好的方案进行实验操作，小组成员相互协作，认真记录实验过程中的各项数据和现象。
（2）在实验过程中，注意安全，严格遵守实验操作规程。
4、结果分析与讨论（1）对实验数据进行整理和分析，计算酶的活力值，并绘制相关图表。
（2）小组成员共同讨论实验结果，分析影响酶活力的因素，找出实验中存在的问题和不足之处。
一、实验目的1. 了解固定酶的概念、原理和特点；2. 掌握固定酶的制备方法；3. 探究固定酶在酶促反应中的催化活性。
二、实验原理固定酶是指将酶固定在固体载体上，使其在催化反应过程中保持稳定性和重复使用性的酶。
固定酶具有以下特点：1. 催化活性高，稳定性好；2. 可重复使用，降低成本；3. 便于分离、纯化和回收。
固定酶的制备方法主要有吸附法、交联法和包埋法等。
本实验采用吸附法固定酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白酶- 牛奶- 硅胶- 酶反应缓冲液- pH试纸- 移液器- 离心机- 酶标仪2. 实验仪器：- 烧杯- 玻璃棒- 移液管- 恒温水浴锅- 酶标仪四、实验步骤1. 准备固定化蛋白酶（1）将蛋白酶溶液与硅胶混合，比例为1:10；（2）搅拌均匀，使蛋白酶充分吸附在硅胶表面；（3）将混合液倒入烧杯中，加入适量的酶反应缓冲液，调节pH值至蛋白酶的最佳pH值；（4）将烧杯放入恒温水浴锅中，恒温30分钟；（5）取出烧杯，用玻璃棒搅拌，使固定化蛋白酶充分分散；（6）用离心机离心，去除未吸附的蛋白酶溶液；（7）收集固定化蛋白酶，备用。
2. 酶促反应（1）将固定化蛋白酶与牛奶混合，比例为1:10；（2）用pH试纸检测混合液的pH值，确保在蛋白酶的最佳pH值范围内；（3）将混合液放入恒温水浴锅中，恒温30分钟；（4）取出混合液，用酶标仪检测酶促反应的活性。
五、实验结果与分析1. 固定化蛋白酶的制备通过吸附法固定蛋白酶，成功制备了固定化蛋白酶。
固定化蛋白酶在离心后，与未吸附的蛋白酶溶液分离，说明固定化效果良好。
2. 酶促反应活性在酶促反应中，固定化蛋白酶对牛奶中的蛋白质具有催化分解作用。
通过酶标仪检测，固定化蛋白酶的酶促反应活性较高，表明固定化酶具有良好的催化效果。
六、实验结论1. 固定酶是一种具有催化活性高、稳定性好、可重复使用等特点的酶；2. 吸附法是一种有效的固定酶制备方法；3. 固定酶在酶促反应中具有较好的催化效果。
酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的活性及其影响因素，掌握测定酶活力的基本方法和原理，以及学会使用相关仪器和试剂进行实验操作。
二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质或核酸。
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用在一定条件下酶催化反应的速度来表示。
本实验采用分光光度法测定酶活力，其原理是基于酶催化反应所产生的产物在特定波长下具有光吸收特性，通过测定反应体系在该波长下吸光度的变化，可以计算出酶催化反应的速度，从而反映酶的活力。
以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。
在本实验中，通过加入一定量的过氧化氢溶液，使其与过氧化氢酶反应，然后使用高锰酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢，根据高锰酸钾溶液的用量计算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝或土豆等富含过氧化氢酶的组织。
过氧化氢溶液（3%）。
高锰酸钾溶液（002 mol/L）。
磷酸缓冲液（pH 70）。
2、实验仪器研钵。
离心机。
移液器。
分光光度计。
恒温水浴锅。
试管、量筒、容量瓶等玻璃仪器。
四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜的猪肝或土豆组织_____g，置于研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，以_____rpm 的转速离心_____min，取上清液即为粗酶液。
2、酶活力的测定取_____支试管，分别标记为 1、2、3。
在 1 号试管中加入_____mL 磷酸缓冲液（pH 70）作为空白对照，在 2、3 号试管中分别加入_____mL 粗酶液。
向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，并同时开始计时。
在反应进行_____min 后，迅速向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 浓度为 2 mol/L 的硫酸溶液终止反应。
用移液器吸取_____mL 反应液，加入到另一支装有_____mL 高锰酸钾溶液（002 mol/L）的试管中，摇匀。
实验六十二固定化酶制备及酶活力测定实验项目性质：综合性所涉及的知识点：酶固定化、酶活测定计划学时：6学时一、实验目的1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。
2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
二、实验原理酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。
在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。
固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。
将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。
酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法（图1-1-1）等。
载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上。
一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。
最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。
交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。
实验六十二固定化酶制备及酶活力测定
实验项目性质：综合性
所涉及的知识点：酶固定化、酶活测定
计划学时：6学时
一、实验目的
1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。
2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
二、实验原理
酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。
在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。
固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。
将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。
酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法（图1-1-1）等。
载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上。
一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。
最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。
交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。
常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。
参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。
交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。
包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。
所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。
将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。
但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。
加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。
图1-1-1 酶固定化模式图
三、实验用品
1. 试剂
（1）海藻酸钠、3.0％氯化钙；
（2）碱性蛋白酶：精确称取干酶粉1克，加入10 mL pH 10缓冲溶液，在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静止片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL容量瓶中。
用缓冲溶液定容至刻度，充分摇匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸取滤液10 mL，移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液为稀释1000倍的酶液（1.0 mg /mL）。
（3）福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350mL蒸馏水、25 mL 85％磷酸及50mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500 mL。
过滤，置于棕色瓶中暗处保存。
使用前加4倍蒸馏水稀释。
（4）1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2 mol/L NaOH 4mL，充分研磨，用蒸馏水洗入100 mL容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100mL，保存于冰箱内。
（5）p H 10缓冲溶液：
甲液（0.05 mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。
乙液：0.2 mol/L氢氧化钠溶液。
配制pH 10硼砂氢氧化钠溶液：吸取甲液50 mL，再加入乙液21mL，用蒸馏水定容至200 mL。
（6）标准酪氨酸溶液：精确称取酪氨酸50mg，加入1mL 1mol/L盐酸溶解后用蒸馏水定容至50 mL，即得1 mg/mL酪氨酸标准溶液。
（7）0.4 mol/L碳酸钠溶液，0.4 mol/L三氯醋酸溶液。
2. 仪器
磁力搅拌器、恒温水浴锅、、注射器、烧杯（100 mL，500 mL）、布式漏斗、分析天平、
容量瓶、移液管、分光光度计；
四、实验步骤
1.酶的固定化
称取1.00 g海藻酸钠于盛有30 mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20 mL。
用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200 mL 3.0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30 min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。
2.酶活力测定
制备酪氨酸标准曲线
(1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。
（见下表）
(2) 在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40℃水浴中保温15 min，取出后，加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。
(3)分别吸取滤液1mL放入另7支试管中，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸馏水，充分摇匀。
(4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm处测定光密度。
(5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
表酪氨酸标准曲线制作
试管编号酪氨酸含量
（μg）1㎎/mL酪氨酸
标准溶液（mL）
蒸馏水
( mL )
0 1 2 3 4 5 6 0
100
200
300
400
500
600
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
固定化酶活力测定
上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15min后，取3 mL置于试管中，加3 mL三氯醋酸溶液。
对照管为1 mL缓冲液＋1 mL蛋白酶液＋3 mL三氯醋酸溶液＋1 mL 1%酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min。
摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1 mL，充分摇匀，于40℃水浴保温15min，然后每管各加入3 mL蒸馏水，摇匀。
用721型分光光度计在波长680 nm处，以对照管为对照，测定吸光值。
3.结果与计算
2.本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：
1克碱性蛋白酶粉在pH 10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位（U）。
3.本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算：
每克碱性蛋白酶的活力单位= m / t ×f
m：样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg）；
t：酶促反应的时间（15 min）；
f：酶的稀释倍数，本实验中f = 1000；
五、注意事项
1.酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40℃以下后再加入酶
液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。
2.固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠－酶混合物向CaCl2溶液滴加的速度不要过快，混合物
要呈颗粒进入CaCl2溶液，以免形成念珠状颗粒。
六、思考题
1.4种固定化酶方法各自的优缺点是什么？
2.酶活力测定过程中应注意哪些问题？
3.。
