仪器分析高效液相色谱法

第八章- 1 - 第八章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatograph)

第一节 概述（Generalization）

以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。

HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。

高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）是最常使用的化学键合相。

根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。

一、 高效液相色谱法的特点

目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传质阻力小，分离效率高。早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备，液膜厚度df大，这和GC一样，会大大降低色谱柱的柱效。现代HPLC填料大多采用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。高效固定相会带来什么新问题呢？使用高效填料带来两个新问题：一是柱流动阻力大大增大，因此需要采用高压泵输液；二是表面能很大，要采用专业的装柱技术。

高效液相色谱法

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱的内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10um。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2um）填充剂的耐超高压、小进样器、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

（1）色谱柱

反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度，填充剂的性状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值得检验操作规程 - 2 -

流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

高效液相色谱法

1 简述

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离侧定的色谱方法。注人的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.1 对仪器的一般要求

所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。色谱柱内径一般为3.9～4.6μm，填充剂粒径为3～10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。

1.1.1 色谱柱

反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的分离通常使用手性填充剂。

第17章 HPLC法

17.1 内容提要

17.1.1 基本概念

高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。

高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。

梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。也称为梯度淋洗。

低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。

高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。 两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。

柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。

液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。

液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。分配系数较大的组分保留值也较大。 正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。

反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。

化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。