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EPO对缺氧缺糖受损神经细胞的作用探究

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中图法分类：R72 学校代码：10661学号：2011290 密级：公开硕士学位论文（专业学位）EPO对缺氧缺糖受损神经细胞的作用研究Protective effect of EPO on nerve cell hypoxia and glucosedeprivation姓名：廖钊专业：儿科学研究方向：小儿神经系统导师：王建怡教授培养单位：遵义医学院2014 年5月目录1.论文： (01)中英缩略词对照表 (04)中文摘要 (04)英文摘要 (05)前言 (06)材料与方法 (08)结果 (19)讨论 (21)结论 (24)参考文献 (25)2.综述： (28)3.致谢 (37)4.作者简介 (38)中英文缩略词表缩略词英文全称中文全称EPO Erythropoietin 促红细胞生成素CNS Central nerous system 中枢神经系统NSE Neuron specific enolase 神经元特异性烯醇化酶PBS Phosphate buffered saline 链霉亲和素生物素化合物FCM Flow cytometry 流式细胞仪DMEM Dulbecco’s modified cagle’s mediu DMEM 培养基FBS Fetal bovine serum 胎牛血清PDL Poly-d-lysine 多聚右旋赖氨酸MTT 3-（4，5-dimethylthialzol-2-yl）-2-5diphenyl-tetrazolium bromide四甲基偶氮唑蓝DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜OD Optical density 吸光度d day 天h hour 小时min minute 分钟EPO对缺氧缺糖受损神经细胞的作用研究中文摘要目的：建立缺氧缺糖神经细胞损伤模型，探讨EPO发挥神经保护作用的可能机制，希望为EPO在神经系统疾病的临床应用提供理论依据。

方法：将出生后24h内C57BL/6小鼠的大脑皮质神经元原代培养7-10d后，神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolase, NSE）免疫组化染色方法鉴定神经元的纯度；用含连二亚硫酸钠的无糖Earle’s液模拟大脑缺血缺氧性损伤，建立缺氧缺糖神经细胞损伤模型。

分组：1、正常组；2、模型组（缺氧缺糖神经细胞损伤模型）；3、EPO组(EPO组干预的缺氧缺糖神经细胞损伤模型）。

MTT检测细胞存活率、FITC-Annexin V/PI荧光染色方法检测细胞凋亡率、测定LDH漏出率，观察EPO对缺氧缺糖损伤神经元的保护作用。

结果：1、成功原代培养神经细胞，经NSE免疫组化方法鉴定神经元纯度大于90%；2、建立缺氧缺糖神经细胞损伤模型，模型组中神经细胞凋亡率为（15.2±0.37），LDH漏出率为（20.4±0.33），细胞存活率为（54.1±0.51），与正常组相比差异有统计学意义（P<0.01）；3、与模型组相比，EPO组的细胞凋亡率、LDH漏出率低于模型组，细胞存活率高于模型组（P<0.01）。

结论：原代培养小鼠神经细胞，成功构建缺氧缺糖神经细胞损伤模型。

EPO能够减轻缺氧缺糖对神经元的损伤，该保护作用可能是通过抑制神经细胞凋亡途径介导完成。

关键词：促红细胞生成素；神经细胞；保护作用1Effect of EPO on nerve cells damaged oxygen-glucosedeprivationAbstractObjective: We construced the model of in model of neurons that induced by oxygen-glucose deprivation(OGD),observed protection of EPO to neurons damaged by oxygen-glucose deprivation, and analysed its possible mechanism, hope to suggest a theory theoretical basis for the further understanding of the pathophysiology of the disease in the nervous system, and provide a new ideas in related field.Methods: Within 24h after birth in mice cortical neurons in primary culture after 7-10d, neuron-specific enolase (Neuron specific enolase, NSE) immunohistochemical staining method to identify the purity of neurons; containing sodium dithionite sugar-free Earle's solution simulated hypoxic-ischemic brain injury, hypoxic neuronal injury establish sugar model. MTT assay cell viability, FITC-Annexin V / PI staining was used to detect the apoptotic rate, measured LDH leakage rate of EPO observed protective effect on neurons lack of oxygen and glucose deprivation.Results: 1. Asuccessful primary cultured neurons by NSE immunohistochemistry to identify neurons purity greater than 90%; 2. to establish OGD model, the model successfully identified. OGD neuronal model neuronal apoptosis rate (15.2 ±0.37), LDH leakage rate(20.4±0.33), cell survival rate was(54.1± 0.51), there was significant difference compared with the control group (P<0.01), the model was constructed successfully;3. apoptosis rate EPO group, LDH leakage rate of less than OGD injury group, cell viability was higher than OGD injury group(P<0.01). Conclusion:The primary cultured mouse neural cells, hypoxia and lack of injury model was successfully constructed sugar nerve cells. EPO can reduce OGD on neuronal damage, the protective effect may be through inhibition of apoptosis and promote nerve cell regeneration pathways mediated completed.Conclusion: Primary cultured mouse neural cells, hypoxia and lack of injury model was successfully constructed sugar nerve cells. EPO can reduce OGD on neuronal damage, the protective effect may be through inhibition of apoptosis and promote nerve cell regeneration pathways mediated completed.Key Words: Erythropoietin; Nerve cells; Protective effect前言促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）是一种由166个氨基酸组成的含唾液酸的酸性糖蛋白，是糖蛋白质激素，骨髓中血红细胞前驱的细胞因子。

EPO与其受体（EPO receptor, EPOR）广泛存在于人和动物体内的组织和器官中，在中枢神经系统（Central nervous system, CNS）中神经细胞及胶质细胞均有表达。

缺血缺氧性脑病或者其他形式的脑损伤（如脑外伤、脑卒中、蛛网膜下腔出血）都会使神经组织中的EPO及EPOR表达上调。

此外，在一些慢性神经系统疾病（如阿尔海默氏病、精神分裂症等）EPOR的表达也会上调。

目前有大量实验发现，EPO对CNS具有重要的调节和保护作用。

EPO能够抑制神经细胞的凋亡，降低缺血缺氧脑病氧化应激的程度及炎症反应，提高脑损伤后的恢复能力，促进新生血管的生成，增加神经细胞的存活量。

有研究报道，在新生大鼠脑出血的模型中，利用实时荧光定量PCR能够检测到EPO可以减少大鼠脑内INF-β，IL-6，TNF-α的mRNA，并降低神经细胞凋亡的数量[1]。

Mazur M等用小鼠缺血缺氧模型，发现早期使用EPO干预能够使小鼠大脑受损的EPO配体及其与受体的协调关系得到恢复，并增加神经细胞的存活数量[2]。

另外Souvenir R等也在该模型中观察到，EPO可增强基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMP)1的活性，Janus激酶2、信号转导子以及转录激活子3的磷酸化水平，减少MMP9的活性，从而提高神经元细胞的存活量[3]。

另外Kim MS等也在该动物模型中发现，EPO可增加小鼠脑内Bcl-2，降低Bax 和caspase-3等mRNA，从而调节抑制神经细胞的凋亡[4]。

近年来研究还发现，EPO能够保护缺血和再灌注损伤导致的星形胶质细胞肿胀，从而减轻脑水肿，缓解大脑损害。

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rhEPO对缺糖缺氧大鼠星形胶质细胞的保护作用及对其DNA甲基转移酶的影响

rhEPO对缺糖缺氧大鼠星形胶质细胞的保护作用及对其DNA甲基转移酶的影响


损伤程度 ， Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ测定 Ｄ ＮＭＴ １ 、 Ｄ ＮＭＴ ａ Ａ／ ３ Ｂ ｍＲＮＡ 的表 达 变化 。结 果 在 缺 糖缺 氧 培 养 组 ， 星 形 胶 质 细 胞 在 ＯＧ Ｄ
培养后 ｌ ｈ出 现 死 亡 并持 续加 重 ， 至５ ～６ ｈ时死 亡 率 达 到 高 峰 ； ２ ０ Ｕ／ ｍｌ ｒ ｈ Ｅ Ｐ Ｏ 组和 １ ０ ０ Ｕ／ ｍｌ ｒ ｈ Ｅ Ｐ Ｏ组细胞 死亡率 ， 星形胶质细胞 Ｄ ＮＭＴ １ 、 Ｄ ＮＭＴ ３ Ａ ／ ３ Ｂ ｍＲ ＮＡ 水 平 均 低 于 Ｏ ＧＤ 对 照 组 （ Ｐ＜ Ｏ ． ０ ５或 Ｐ＜ Ｏ ． ０ ０ １ ） ， 但 不 同浓 度 ｒ ｈ Ｅ Ｐ Ｏ 对 Ｄ ＮＭＴ３ Ａ ／ ３ Ｂ影 响 差 异 无 统 计 学 意义 （ Ｐ＞ Ｏ ． ０ ５ ） 。结 论 ｒ ｈ Ｅ Ｐ Ｏ 可 以 对 缺 糖 缺 氧 培 养 大 鼠 星 形 胶 质 细 胞 起 到 保 护 作
第３ ８卷 第 ６期 ２ ０ １ ６年 １ ２Hale Waihona Puke 右江 民族 医学 院学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｙｏ ｕ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｆ ｏ ｒ Ｎａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｉ ｔ ｉ ｅ ｓ
Ｖｏ １ ． ３ ８ ＮＯ． ６
０ １ ４ ０ ４ ０
２ ．内蒙古包 头市第 四医院 ， 内蒙古 包 头
０ １ ４ ０ ４ ０ ）
摘
要 ：目 的 研 究 重组 人 促 红 细 胞 生 成 素 （ ｒ ｈ Ｅ Ｐ Ｏ） 对氧 糖剥 夺（ ＯＧ Ｄ） 条 件下 大鼠星形 胶质 细胞 Ｄ ＮＡ 甲基 转 移 酶
（ Ｄ ＮＭＴ） 水 平 的影 响 。方 法 用 不 同 浓度 ｒ ｈ Ｅ Ｐ Ｏ 与星 形 胶 质 细 胞 在 ＯＧ Ｄ条件下共培养 ６ ｈ ， 用 台 盼 蓝 拒染 法 测定 细胞
促红细胞生成素对心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用

促红细胞生成素对心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用

促红细胞生成素对心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用目的探讨促红细胞生成素(EPO)对心肌细胞缺氧／复氧(HR)损伤的保护作用及其机制。

方法对乳鼠心肌细胞进行原代分离培养，并缺氧2h，复氧1h，建立HR损伤模型。

心肌细胞随机分为四组：正常细胞培养组(空白组)，HR组，HR+EP010U／ml组(EPO组)，HR+EPO10U／ml+UO12610μmol／L组(uo126组)。

全自动生化分析仪检测各组细胞培养液LDH活性；MTT法检测心肌细胞活性；TuNEL法：流式细胞仪Armexin-v-FITC法检测凋亡心肌细胞；Western-blot法测定各组心肌细胞ERK和磷酸化ERK蛋白含量。

结果EPO显著降低心肌细胞HR损伤后LDH的漏出，增强细胞的活性，减少细胞的凋亡比例，提高ERK蛋白磷酸化水平；而经过126(MAPK的阻滞剂)的处理，心肌细胞LDH外溢量增加，细胞活性显著下降，凋亡细胞的比例明显增加，且ERK蛋白磷酸化水平显著降低。

结论EPO对心肌细胞HR损伤有一定的保护作用，其机制与ERK信号通路的激活及抑制心肌细胞凋亡有关。

标签：促红细胞生成素：缺氧／复氧损伤；凋亡；丝裂原活化蛋白激酶促红细胞生成素(erythrpoletin，EPO)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素。

临床上，重组人红细胞生成素(rhEPo)已被广泛用于治疗各类贫血。

近来研究发现，EPO还具有抗凋亡，促血管生成，调节炎症反应等作用，对多种器官有保护作用，但对于其在心肌缺血－再灌注损伤(myocardialischemia-reperfusion MIRI)方面的研究于2004年始有报道。

本实验通过建立乳鼠心肌细胞缺氧复氧(hypoxia ／reoxygenation，HR)损伤模型在体外模拟MIRI的过程，研究EPO对MIRI的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

1材料与方法1．1材料注射用促红细胞生成素(商品名依倍，成都地奥制药有限公司，批号A20050402)，厌氧培养盒，厌氧产气袋(Blomerleux，法国)，RIPA(能博彩生物，上海)，UO126(康成生物，上海)，p44／42MAPK抗体，磷酸化p44／42 MAPK 抗体(Cellsignaling Technology，美国)，流式细胞仪(B&D公司，美国)，Annexin-V-FITC凋亡检测测试盒(BlOViSion公司，美国)。

EPO在脑缺血神经保护作用中的研究进展

EPO在脑缺血神经保护作用中的研究进展


ｔ ｅ 类 受体离 子通 道与 兴奋 性 氨 基 酸引 起 的钙 渗 透 ａ） ｔ
有 着密切 联系 ¨ 。 ２ 细 胞 内钙超 载 ： ． 在较 长时 间 的脑 缺 血过 程 中 ，
细胞膜去 极化会伴 随着 细胞能量 代谢缺 失 ， 而导 致 继 钙离子 内流 。由于 Ｎ Ａ类 型 谷 氨酸 受体 的过度 表 ＭＤ 达而 导致 的大量 钙 离 子 内流 。钙 超 载触 发 一 系列 的
激 素。天然 生 成 的 Ｅ Ｏ分 两 种 ：ｔ 和 Ｂ型 。Ｏ 型 Ｐ Ｏ型 ｔ
含 ３ ％ 的糖类 ， ４ Ｂ型 含 ２ ％ 的糖 类 。两 种 类 型 在 生 ６ 物学特性 、 抗原性及 临床应 用效 果上均 相 同。 以前 的 研究认为 Ｅ Ｏ仅 具有促 红细 胞生 长作 用 。 由于 Ｅ Ｏ Ｐ Ｐ
谷氨 酸 Ｎ Ａ亚 型 受 体 ， 使 Ｃ 大 量 内 流 ， 导 ＭＤ 促 ａ 诱 ｎＯ Ｎ Ｓ表达 引起 Ｎ Ｏ合 成 大 量 增 加 。ｉ Ｏ Ｎ Ｓ的 诱 导 表 达也 受 ｃ “ 的影 响 ， 为 Ｎ Ａ Ｃ “ － Ｏ通 路 。另 ａ 即 ＭＤ ． ａ Ｎ 外 ， Ｏ作 用 于 含 铁 蛋 白并 产 生 毒性 作 用 。 Ｎ Ｎ Ｏ极 易
有 害代谢 ： 激活某 些钙 离子 依赖性 蛋 白酶参 与神经元
凋亡 ； 白酶 的激 活使细 胞结构 蛋 白溶解 ， 胞塌 陷 、 蛋 细 变形、 突出小泡及 芽 变形 成 ； 氨 酰胺 转 移 酶 的激 活 谷 使细胞 质和细 胞膜蛋 白绞链受损 。
基 金 项 目： 国家 自然科 学 基 金 面 上项 目 （０ ７７ ５ ３６ ０ ２ ）
３ 一氧 化氦 （ Ｏ） ． Ｎ 的毒性 作用 ： 究发 现 ， Ｏ能 研 Ｎ 引起 巨噬细胞 和单 核 细 胞 的凋 亡 。脑缺 血 及 再灌 注 后缺 血脑 组 织 Ｎ Ｏ含 量 明 显 升 高 ， 达 基 线 水 平 的 可
Epo除了促进红血球的产生之外还可以保护神经细胞免受细胞死亡

Epo除了促进红血球的产生之外还可以保护神经细胞免受细胞死亡

Epo除了促进红血球的产生之外还可以保护神经细胞免受细胞死亡促红细胞生成素(Epo)激素是一种众所周知的掺杂物质，在耐力运动(如骑自行车)中有悠久的历史。

Epo除了促进红血球的产生(红细胞生成)(这可以改善生物体中的氧气供应)之外，还可以庇护神经细胞免受细胞死亡。

然而，为了利用这种作用来治疗神经退行性疾病，需要防止由Epo通过刺激的红细胞形成引起的负面作用。

哥廷根大学的研究人员现在已经发现了另一种Epo受体，该受体也可能触发对人类的庇护作用，而对红细胞生成没有副作用。

研究结果颁发在《分子神经科学前沿》杂志上。

Epo可用于治疗神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症，或减少中风后的损伤。

然而，临床研究显示出严重的副作用，按照目前的知识，这很可能是由于Epo刺激红细胞产生的能力。

如何将Epo的细胞庇护作用与对血细胞形成的作用区分开?哥廷根大学细胞神经科学系的研究人员已经确定了另一种Epo受体。

他们发现，用人Epo进行的治疗还可以防止某些昆虫的细胞死亡，尽管这些动物本身不具有Epo，也没有参与人类红细胞生成的经典Epo受体。

他们的结论是：在lf游蝗中，拉尔夫·海因里希(Ralf Heinrich)教授的研究小组现在已经能够证明CRLF3(类似于细胞因子受体的因子3)就是这种Epo受体的替代物。

来自蝗虫大脑的神经细胞培养物在缺乏氧气的情况下死亡，类似于中风患者的脑细胞。

通过添加人Epo，可以保留蝗虫脑细胞，但前提是只要不人工按捺细胞中CRLF3受体的存在即可。

研究小组能够在总共293种不同的动物物种中识别出该受体。

其中有259只脊椎动物，包罗人类。

在进化史上，CRLF3与神经系统发育同时出现，这表白该受体在神经细胞中起重要作用。

蛋白质序列的相似性是令人惊讶的：CRLF3从刺胞(例如水母)到人类仍然非常相似。

现在的重要问题是CRLF3的激活是否还可以防止我们大脑中的细胞死亡。

在结构上，蝗虫和人类的CRLF3受体非常相似。