果树基因工程研究进展及展望

专题综述 果树基因工程研究进展及展望王关林　方宏筠(辽宁师范大学生命科学院,大连116029) 果树的基因型多为杂合型,杂交后代会产生复杂多样的分离。

因此,把许多优良性状集中在一个果树品种上是非常困难的〔1〕。

果树基因工程为果树育种开辟了新的途径,有着重要的理论与实践意义。

本文综述了迄今国内外果树基因工程的研究进展、果树基因转化的方法、主要影响因素及基因工程对果树遗传改良的潜力和应用前景,最后根据目前果树基因工程面临的问题和作者的研究工作体会提出了新的研究方向。

1　果树基因工程研究概况1983年,科学家们首次利用农杆菌(A g rabacterium tum ef aciens)介导将np t II外源基因导入烟草,获得转基因植株〔2〕。

1988年,果树的基因转化研究首先在核桃(J ug lan ts rig ia)上取得突破,M cGranahan等获得了转g us基因核桃再生植株。

此后,果树转基因工程研究日益发展,许多果树获得了转基因植株(表1)。

但是与农作物的转基因工程研究相比,果树转基因工程还是远远处于落后状态。

最难转化的禾谷类,现在也已经有多种作物进入转基因的商业化生产阶段,而果树仅有一例转基因植物进入田间试验〔3〕。

我国果树转基因工程的研究起步较晚,但进展很快。

从表1可以看出,我国在樱桃、草莓、苹果等果树转基因方面做了许多研究工作,并都获得了转化目的基因的转基因植株,特别是樱桃的转抗菌肽基因已由农业部批准进入田间实验,该项研究处于国际领先水平。

表1　转基因果树名录果树树种和品种目的基因转化系统受体系统核桃g us根癌农杆菌体细胞胚〔4〕icp根癌农杆菌体细胞胚〔5〕chs发根农杆菌体细胞胚〔6〕(黑核桃)g us根癌农杆菌体细胞胚〔7〕3苹果g us1np t根癌农杆菌不定芽再生〔8〕icp根癌农杆菌不定芽再生〔9〕icp根癌农杆菌不定芽再生〔10〕(M26砧木)Ho r mone发根农杆菌不定芽再生〔11〕ip t根癌农杆菌不定芽再生〔12〕3g us根癌农杆菌不定芽再生〔13〕3 (皇家嘎拉)bt根癌农杆菌不定芽再生〔14〕3cp ti根癌农杆菌不定芽再生〔15〕3草莓g us根癌农杆菌不定芽再生〔16〕3g us电激法原生质体〔17〕bt发根农杆菌不定芽再生〔18〕g us根癌农杆菌不定芽再生〔19〕3葡萄np t II根癌农杆菌不定芽再生〔20〕g us根癌农杆菌不定芽再生〔21〕g us基因枪悬浮细胞〔22〕樱桃C ecrop in B根癌农杆菌茎尖转化〔3〕3桃g us根癌农杆菌胚〔23〕李cp根癌农杆菌胚〔24〕杏cp根癌农杆菌胚〔25〕猕猴桃ca t电激法原生质体〔26〕rol A1B1C根癌农杆菌不定芽再生〔27〕柑橘g us根癌农杆菌悬浮细胞〔28〕np t II根癌农杆菌不定芽再生〔29〕(获得愈伤组织)np t II DNA直接导入原生质体〔30〕蔓越橘g us1icp基因枪不定芽再生〔31〕柠檬np t II DNA直接导入原生质体〔32〕番木瓜np t II根癌农杆菌愈伤组织〔33〕np t II基因枪愈伤组织〔34〕红树莓g us根癌农杆菌不定芽再生〔35〕黑莓g us根癌农杆菌不定芽再生〔35〕黑茶鹿子g us根癌农杆菌不定芽再生〔36〕 注:3为国内学者报道。

本文于2001211205收到,2002201207收到修改稿。

2　果树基因转化系统的选择及其影响因素211　果树基因转化系统的选择植物转基因方法归纳起来可划分为3大转化系统。

第1种是以质粒DNA或RNA为载体的转化系统,即目的基因重组在载体DNA上,并随着载体DNA的转移而实现转化,最典型的是农杆菌T i质粒转化系统。

该转化系统是目前使用最多、机理最清楚、技术最成熟、成功实例最多的一种转化系统,也是植物基因工程中最重要的一种转化系统。

据统计,果树转化成功的实例中90%以上是采用该系统。

该系统的缺点是农杆菌对单子叶植物不敏感,特别是禾本科植物。

果树是双子叶植物,因此农杆菌质粒载体转化系统是果树基因转化的首选方法。

第2种类型是不利用任何载体,而采用化学或物理方法直接将外源基因导入受体细胞,故称为直接转化系统。

其最大优点是无宿主范围,适用于各种植物。

但是它也存在许多不足之处:转化目的基因的拷贝数多,结构变化复杂,获得单拷贝整合的植株困难;转基因植株的遗传特性复杂,稳定性差;转基因植物的表达困难,沉默现象严重等,特别是至今许多转化中的理论问题还不清楚。

第3种转化系统是巧妙地利用植物自身生殖系统的细胞或结构为媒体进行转化,例如通过花粉粒、花粉管、胚珠、卵细胞等进行转化,操作简单,方便易得,不需复杂的仪器设备,但该方法的机理至今仍有异议,特别是受到开花季节的限制,转化时间十分短暂。

M cCabe等〔37〕在1988年首次用基因枪转化大豆茎尖分生细胞获得成功以来,茎尖生长点细胞的转化日趋受到重视。

果树茎尖培养的再生系统技术成熟,茎尖转化是果树中值得采用的方法。

方宏筠等利用农杆菌获得樱桃茎尖抗根癌病的转基因植株,并已进入田间试验〔3〕,为果树茎尖基因转化提供了理想的方法。

他们的研究方法表明,果树茎尖转化具有如下特点:①再生能力强,容易获得转基因植株;②对侵染损伤及Km(卡那霉素)的耐受力强;③转化频率高;④茎尖细胞不经脱分化过程直接分化出不定芽,所获得的转基因植株无性系变异少;⑤超小剥离茎尖再生转化植株同时具有脱病毒效果。

其缺点是,由于茎尖对Km的耐受性较强,故“逃逸”芽及嵌合体较多,但只要多次继代筛选就可以解决此问题。

根据受体植物和转化系统的特性,选择适宜的转化方法,有利于转化的成功。

果树基因转化系统的选择归纳起来可遵循以下原则:①一般果树对农杆菌都敏感,是其良好的寄主植物。

农杆菌转化系统是果树基因转化的首选方法。

②绝大多数果树具有杂合的遗传背景,因此不宜采用单倍体的生殖细胞进行转化,如花粉管导入、子房注射法等。

但为了扩大转基因植株多样性,则可采用生殖细胞转化。

③原生质体培养容易的果树可采用DNA直接导入法。

但是目前原生质体培养能够达到基因转化受体系统条件的果树很少。

④多胚珠的果树如猕猴桃等可采用花粉管导入法转化,涂抹在柱头上的DNA可随着许多花粉管进入子房,分别导入各卵细胞中,提高转化率,实现转基因植物的多样性。

⑤子房中有较大单胚珠的果树如核果类果树,宜使用微射注射法,有利于外源DNA直接注入胚珠。

⑥茎尖培养再生丛生芽受体系统,宜采用农杆菌侵染茎或基因枪转化茎尖。

212　影响果树基因转化的主要因素果树基因工程难度较大,这种困难是因为转基因的成功率太低。

影响农杆菌转化率的主要因素有以下几个方面。

21211　农杆菌的侵染能力及载体的影响农杆菌的侵染能力与转化率有着直接的关系,也是转化成败的主要因素之一。

农杆菌的侵染能力取决于农杆菌本身的特性及受体植物对它的敏感性。

就农杆菌而言,其侵染能力与农杆菌种类及载体质粒的结构有关。

农杆菌分三大类菌系,即胭脂碱型(N opaline typ e, N op)、章鱼碱型(O cop ine typ e,O ct)及农杆菌碱型(A grop ine type)亦称琥珀碱型(Succinem op ine typ e,Suc)。

N op型菌株的特点是染色体背景为C58,生长速度快、不结球、易操作,常用的工程菌株有C58、pGV3850、A208SE等。

O ct型菌株的特点是其染色体背景为A ch s,生长慢,菌株培养过程中结球,在转化实验中不利于操作,共培养后不易洗掉,常用的工程菌株有LBA4404、LBA104。

Suc型菌株的特点是染色体背景为A281或A136,具有N op型菌株的特点,常用的工程菌为EHA101和EHA105,它们具有生长快、不结球等优良特性,这两种菌株的侵染能力都很强。

我们进行了菌株种类对多种果树的侵染能力比较研究,结果表明EHA105是理想的果树基因工程转化载体系统,该菌株具有生长快、不结球、转化中易操作、共培养后易洗脱、对C ef敏感、侵染能力强、寄主范围宽等特性。

我们利用该菌株已成功获得了苹果、樱桃、草莓等多种转基因植株。

21212　农杆菌v ir基因的活化v ir基因的活化是农杆菌转化的域阀。

v ir 区有v ir A、B、C、D、E、F、G、H7个操纵子共24个基因,共同起调控作用,它们与T2DNA 的加工和转移有关。

v ir区基因的活化在农杆菌转化中的作用十分重要,因此凡能增强v ir 基因活化的因子都能提高其侵染能力。

常用的v ir基因诱导物是乙酰丁香酮(aceto syringone,A S)。

关于诱导物的使用常采用以下3种方法:①在农杆菌液体培养时加A S,加入时间一般在制备工程菌侵染液使用前4～6小时加入。

②A S加在农杆菌和外植体共培养的培养基中。

③在农杆菌液体培养基中及共培养基中都加入A S。

这种方法似乎最牢靠,只不过是使用的A S 诱导剂太多了。

然而,也有很多实验表明不加诱导物同样可以实现转化的目的。

另外在苹果叶片转化中发现,与A S同时加入诱导稳定剂甜菜碱(l mm o l L)或脯氨酸(lum o l L),对v ir 基因活化有协同作用。

研究发现,pH值对v ir区的活化有着明显的影响,从理论上讲含A S的培养基pH值为510～516时,v ir区基因的诱导达到最高水平, pH值改变013,即对多种植物的转化率有明显的影响。

章鱼碱型和农杆菌碱型菌系比胭脂碱型需要更低的pH值。

通常农杆菌培养时pH值为712。

这种生长旺盛的菌株v ir基因均处于不活化状态。

植物组织培养基中的pH值常为518,有利于v ir基因的活化。

在v ir基因活化诱导中应注意调整培养基的pH值。

此外,v ir基因活化还受到其他因素的影响,如温度,v ir D及v ir G的活化必须低于28℃;培养基中还应加酵母提取液;培养基中的糖或高浓度的肌醇可促进v ir基因表达。

21213　果树基因转化受体系统的建立果树基因工程研究进展缓慢的另一个重要原因是其高频再生受体系统的建立尚未完善。

为了使转基因的植株保持原有的优良性状,应采用叶片、茎段等外植体直接大量分化不定芽的途径。

但是目前许多果树难以实现用叶片、茎段等外植体直接大量分化不定芽,制约了果树基因转化的进程。

茎尖培养快速繁殖体系的研究在果树中已获得成功,作者认为应该大量利用该受体系统进行基因转化研究。

3　展　望果树转基因和其他1年生作物相比有着独特的优点。

一旦获得转基因果树品种,而且目的基因如人们所希望的那样表达,那么它就可以通过组织培养、嫁接或扦插等无性繁殖方式来大量繁殖。

由于不通过有性繁殖,后代性状保持一致,其遗传稳定性好。

(1)利用多基因转化培育超级抗病虫害新品种　许多病毒、真菌、细菌及害虫不仅给果树生产造成巨大的经济损失,而且农药的大量使用造成了环境的污染。