多肽疫苗生产及质控技术指导原则
前 言
多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。传统疫苗一般由两种方式制备，一种为能诱发免疫力却不致病的减毒疫苗，例如黄热病、脊髓灰质炎和麻疹疫苗或卡介苗；另一种为灭活疫苗（例如百日咳杆菌、狂犬病毒、伤寒杆菌）。多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或灭活不全的问题。特别是一些还不能通过体外培养方式获得足够量的抗原的微生物病原体。有些虽能进行体外培养，但这些病原体有潜在致病性和免疫病理作用等涉及安全性与有效性的问题。多肽作为体内引起效应细胞免疫应答形成的免疫原，将成为一种新型的疫苗，但还有很多理论和技术问题要继续研究，目前尚无多肽疫苗获准上市。因此，应采取适当可行的途径对这种潜能疫苗进行生产及质控，并在其生产过程中积累经验，为此，应加强咨询和论证，以便提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终产品的制备，务必制定标准操作规程和质控标准，并予严格实施。
一、多肽疫苗的化学合成
首先应该确定天然抗原的氨基酸序列，选择和确定寻找有效肽段的方法，并寻找该肽段所针对的抗原决定簇。
其次应选择合适的合成方法。合成中等大小的多肽也会涉及众多反应，每加入一个氨基酸需多次反应，在一个氨基酸的α氨基与另一个氨基酸的羧基缩合形成肽链之前，必须使其中一个形成高反应的活化状态，这个选择自然落到羧基上，合成因而从C到N端。如果A氨基酸的C端与B氨基酸的N端缩合产生2肽A－B，则A的N端及B的C端必须保护起来，才能转化成在A－B之间形成特异性肽的形式。此外，氨基肽的侧链基团也能与活化羧基反应，因此也必须保护起来。这些侧链保护基团必须能耐受除去α－氨基保护基团的条件，这样才能生成新的氨基基团使肽链得以继续延长。合成结束后必须除去所有的保护性基团以得到所需的多肽。多肽的合成循环包括了一系列的反应，每一循环生成一个新肽键。 主要有两个合成策略：片段浓缩法和固相合成法（merrifield法）。片段浓缩法是经典的合成技术。首先合成数条小肽，经纯化和去保护后结合成较长的肽，直到最后所需的序列。
疫苗的生产工艺
疫苗的生产工艺是指制造疫苗的过程和步骤。疫苗生产的主要目的是为了预防和控制传染病的流行，保护人类和动物的健康。
一般来说，疫苗的生产工艺可以分为以下几个步骤：
首先，疫苗的研发和筛选。疫苗的研制是一个复杂和持续的过程。一般情况下，研发疫苗需要经历预研、基础研究、实验室评估、临床试验等多个阶段。在研发过程中，科学家会选择核心抗原，并使用特定技术或生产工艺进行晶体化、培养和增殖。
第二步，制备疫苗的原材料。原材料的制备是疫苗生产的关键环节之一。它包括质量可控的生物材料、培养基和其他辅助材料。这些材料需要通过严格的筛选和检验来确保其质量和安全性。
第三步，疫苗的制备和培养。在这个阶段，科学家会利用原材料，通过特定的方法和技术制备疫苗。这包括病毒培养、分离和纯化等过程。在制备过程中，科学家需要控制各个环节的条件和参数，以确保疫苗的质量和稳定性。
第四步，疫苗的灭活和灭毒。一些疫苗需要进行灭活和灭毒处理，以保证疫苗中的病原体不再具有传染性。这可以通过物理或化学方法来实现，如热处理、辐射灭活、化学灭活等。
第五步，疫苗的配方和调剂。在这个阶段，科学家会根据具体的疫苗类型和需求，进行疫苗的配方和调剂。这包括添加适量的辅料、辅助剂和稳定剂等，以提高疫苗的免疫效果和稳定性。
第六步，疫苗的包装和贮存。在疫苗制备完成后，科学家会将疫苗进行包装，并进行严格的检验和质量控制。包装通常采用瓶装或注射剂，以方便存储和使用。
最后，疫苗的贮存和运输。贮存和运输是疫苗生产的最后一个环节。疫苗需要在特定的温度和条件下存放和运输，以确保其质量和有效性。这通常需要冷链运输或其他特殊的贮存设备。
总结起来，疫苗的生产工艺包括研发和筛选、原材料制备、制备和培养、灭活和灭毒、配方和调剂、包装和贮存、以及贮存和运输等多个步骤。每个步骤都需要科学家严格控制和操作，以保证疫苗的质量和安全性。
Ｐｒａｃｔｉｃｅ实践前沿
第四代疫苗生产技术畅想
从组织培养法到细胞培养法，再到悬浮培养法；从全抗原疫苗到
基因工程疫苗，再ＮＤＮＡ疫苗，三次疫苗变革经历了一个多世
纪，未来将迎来以无疼痛、高效价、使用方便为特点的第四代疫
苗技术革命。
文Ｉ熊英成都天邦生物制品有限公司
５６ １７９６年英国（Ｊｅｎｎｅｒ）医生总结种牛痘预 防天花的经验，从此开始了疫苗的科学发展之
路，而真正将疫苗学发展壮大的，是被称为疫
苗之父的巴斯德（Ｐａｓｔｅｕｒ）。１９世纪中叶，法
国微生物学家巴斯德发现了微生物的存在，为
科学预防疾病找到了理论基础，正式开启了疫
苗之路。
根据疫苗生产工艺的不同，我们认为疫苗 到目前为止现在经历了３ｚ２变革，这３次变革均
是建立在微生物学、免疫学、传染病学、生物
工程学、分子生物学和免疫遗传学等理论的快
速发展基础上的，当然也是工业化时代的微观
体现。１９３２年，Ｔｈｅｉｌｅｒ成功将黄热病病毒通过 鸡胚组织培养传代成功，开启了以采用鸡胚、
动物组织生产疫苗的第一代疫苗技术；自１９４９
年起开启了以动物细胞为基础，转瓶生产方式
为代表的第二代疫苗技术；１９６２年，ＢＨＫ２１细 胞被成功驯化实现了悬浮培养，１９６５年实现了
悬浮培养的口蹄疫疫苗，自此开启了以悬浮培
养技术为先驱的第三代疫苗技术，生产技术的
变革确实将疫苗的使用范围和生产水平提到了
史无前例的地步。第一代技术到第二代技术经
历了约１５年时间，第二代技术到第三代技术也
经历了１５年时间，而第三代技术至今已经历了 ５Ｏ年时间（图１）。随着工业４．０时代的到来，
疫苗的生产技术在历时５Ｏ年后是否会收获４．０时
图１疫苗技术变迁史 ，ｒ 、 第三代疫苗技术
悬浮培养法
１９６５年 ＼Ｌ
图２疫苗变革的时间及标识 代的到来？ 从对疫苗主要成分抗原的了解方面，疫
苗同样经历了３次变革，每次变革都出现了标
志性疫苗。第一次变革即以Ｐａｓｔｅｕｒ于１９世纪
.
1 / 9 细菌性疫苗制造技术
任务一 灭活苗的制造流程
菌种的选择〔强毒株> → 菌液培养 → 灭活
↓ ↓
配苗〔5份菌液+1份铝胶配苗> ← 浓缩
工序一 菌种与种子培养
选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株,按规定定期复壮和鉴定,将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液.种子液保存于2～8℃冷暗处,在有效期内用于菌苗生产种子使用.大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物.如用含大肠杆菌的病料,首先对大肠杆菌进行分离、鉴定,符合要求方可作为菌种使用.
工序二 菌液的培养
用于规模化细菌培养的方法很多,有手工式、机械化或自动化等方式.可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法.一般固体培养易获得高浓度细菌悬液,含培养基成分少,易稀释成不同的浓度,但生产量较小.因此,大量生产疫苗时常用液体培养法.
实例 大肠杆菌的菌液培养方法
<1>．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上,置37℃温箱中培养18～24h,挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面,置37℃温箱中培养18～24h,经显微镜检查无杂菌污染者,即可作为种子培养物.
<2>．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子,用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中,置37℃培养18～24h后作为二级种子.
<3>．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养.如接种到营养琼脂培养基表面,37℃培养24～48h后,加入灭菌生理盐水,用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下,倾入灭菌的离心管中,低速离心5min
<500r/min>,使其中可能掺杂的琼脂块下沉.吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中,用手或振荡器振荡30min,使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用,其余细菌将灭活.
