蛋白质与蛋白质的相互作用

蛋白质与蛋白质的相互作用

蛋白质是由@-氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成高分子化合物。蛋白质在酸性、碱性、酶等发生水解，在水解的过程中生成多肽，但水解的最终产物都是氨基酸。蛋白质还有盐析、变性等性质。

蛋白质与蛋白质的相互作用是功能复合物的基础（如线粒体内膜呼吸链)。蛋白质的表达水平、存在方式及相互作用等直接与生物功能相关，在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。蛋白质的相互作用能产生许多效应，例如它可以改变蛋白质的动力学特性、形成特异底物作用通道、生成新的结合位点、使蛋白质失活、改变蛋白质对其作用底物的专一性等等。蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法较多，目前比较成熟的，有酵母双杂交技术（Y2H） 、噬菌体展示技术（PDT） 、融合蛋白沉降技术、亚细 胞共定定位、免疫共沉淀技术、荧光共振能量转移技术、表面等离子共振、蛋白 芯片技术（抗体与蛋白质整列技术）以及融合蛋白亲和色谱法等。目前，应用于蛋白质的相互作用的研究方法有生物物理学、分子生物学、遗传学等方式。

一、酵母双杂交系统

酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。

二、噬茵体展示技术

在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。

三、等离子共振技术

表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。

四、荧光能量转移技术

荧光共振能量转移（FRET

）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;

与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET

荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP

的供体受体对。

五、抗体与蛋白质阵列技术

蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。

六、免疫共沉淀技术

免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

七、pull-down技术 蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co-IP） 、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。

蛋白质相互作用分析的应用

蛋白质的相互作用能产生许多效应，如改变蛋白质的动力学，形成特异底物作用通道，生成新的结 ２．８ 生物信息学方法 蛋白质之间存在的相互作用可以在基因组座位、序列特征、表达时相、亚细 胞定位、表达量等诸多方面表现出相邻、相似、相关 的性状，通过考察这些性状就可以预测蛋白质之间是否有相互作用Ⅲ。如考察编码蛋白基因在基因合位点，使蛋白质失活，改变蛋白质对其作用底物的专一性等。了解蛋白质相互作用的方式、作用程度、 作用结果，将有助于解决蛋白质功能的分析、生命发 育的探索、疑难病理的研究、有效药物的开发等众多

问题。揭示蛋白质之间的 相互作用关系 ,建立相互作用的网络图 ,已成为蛋白质研究领域中的热点 , 覆盖了从微生物到动植物的各个领域 。

蛋白质与蛋白质相互作用 蛋白质相关知识及研究蛋白质相互作用的必要性有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋 白质都是和伴侣分子或是与其他蛋白质一起发挥作用的。 人类蛋白质组相用 基因组计划--大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序 列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体 现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是 细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过 其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控,介导细胞的许多 生物学活性。为了更好地理解细胞的生物学活性，必须 很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就 会涉及到蛋白质相互作用的研究。因此，揭示 蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关

系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点, 也是后基因时代的难题所在。研究蛋白质相互作用的方法也就具有更为重要的意义。 蛋白质相互作用研究方法 ：生物物理学方法 ，分子生物学方法 ，遗传学方法 ，免 疫 共 沉 淀 串 联 亲 和 纯 化

噬 菌 体 展 示 技 术 酵 母 双 杂 交 技 术 基 因 外 抑

制 子 合 成 致 死 筛 选 Pull down 试 验 GST pull-down技术 1988年Smith等利用GST融合标签从细菌中一步纯化出GST融合 蛋白,从次GST融合蛋白在研究蛋白质相互作用领域得到极大推广(His 也常用)。 原理：把要研究的目的蛋白基因亚克隆到带有GST基因的原核表达载 体中，并在细菌中表达GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探 针)挂到带有GST底物的sepharose beads上，然后把另一种含目的蛋 白质Y的溶液加入其中。由于谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合 蛋白，如发生相互作用则形成复合物：GST-X-Y，沉淀收集下来，后 续用过量游离的谷胱甘肽洗脱非特异结合的蛋白或采用SDS-PAGE鉴 定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质（类似于抗体检测蛋白质的技术）。 此方法常用来验证酵母双杂交试验所得到的相互作用。且只用于确定体外的相互作用，还应当在体内用单独的方法，如免疫共沉淀加 以证实。