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PCR常见问题探讨

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PCR常见问题探讨

PCR 常见问题探讨

上海科华公司 云帆 晖晖

⽬前，核酸检测（主要是指荧光PCR）在临床检验中得到⽇益⼴泛的应⽤，本⽂根据以往的使⽤经验，针对临床PCR扩增检

测中的⼀些常见问题及注意事项进⾏探讨，请同道指正。

1. 关于标本的采集、保存

PCR检测的⽬标是标本中的病原体核酸，分DNA和RNA两种形式，⽽核酸的 稳定性较差，容易因核酸酶的作⽤⽽降解。因

此，对于标本的采集、保存应格外⼩⼼，注意以下⼏点：

（1）⽤于核酸检测的标本采集后应单独分装，不与酶免、⽣化等检测项⽬混装。分离⾎清的离⼼机内腔应经常消毒清洁，避

免使⽤⽆盖试管，否则离⼼过程中可能会因尘埃和⽓溶胶造成标本间的相互污染。

（2）标本采集、保存中所需的离⼼管、吸头等需采⽤⼀次性的⽆核酸酶污染的⽤品，建议采⽤美国AXYGEN公司的相关产

品，如采⽤国产同类产品，需预先进⾏⾼压灭菌等⽅式处理，消除核酸酶的污染。操作时应带⽆荧光物质的⼀次性⼿套。既可

⾃我⽣物防护，同时防⽌⼿上的RNA酶污染样品，使待检标本中的病毒核酸降解。

（3）标本若不及时检测，需分装后冻存，避免反复冻融。

（4）标本应避免溶⾎，因⾎红蛋⽩对Taq酶活性有抑制，并可使荧光淬灭。对于采⽤直接煮沸裂解的核酸提取⽅法影响尤为

严重。

2. 关于核酸提取

PCR检测不同于酶免、⽣化检测，需要对标本进⾏预处理，提取标本中的病原体核酸。该过程的操作⽬前主要为⼿⼯操作，

是影响检测质量的关键因素。需要注意避免标本间的交叉污染及核酸模板的降解、丢失。对于RNA的提取尤为⼩⼼，提取过

程中采⽤的吸头、离⼼管的质量，开盖、吸弃上清等操作不当均会对检测结果造成影响。使⽤Trizol提取RNA时，不同⼈的操

作，RNA得率可能差异很⼤，尤其在加⼊氯仿后，过度的振荡会使样品乳化，虽经离⼼仍不能分层或分层不完全，影响了RNA的回收。建议采⽤操作相对简便，⼈为影响因素较少的柱抽提模式或磁珠核酸提取⽅法。

3. 关于PCR扩增反应液的配制及核酸模板加样

为了确保PCR反应液的稳定性，⼀般商品化的PCR试剂盒会将扩增所需的PCR 反应液分成2～3个组分，临⽤前按⽐例混合。

考虑到吸取、分装试剂时的误差，配制PCR扩增反应液时应⽐所需的待测标本多1～2个⼈份，以免配制的试剂不够⽤。加⼊

提取好的核酸模板时需格外⼩⼼，⼀般PCR扩增所需加⼊的模板量只有2µl，稍有不慎，多加或少加都会对定量结果产⽣很⼤

影响。

某单位对⼀批标本进⾏重复检测，同⼀检验⼈员使⽤同⼀个试剂盒和相同的仪器设备，但检测结果出现不应有的偏差，经过对

整个检测过程的分析，发现是因为检验⼈员从冰箱冷冻室取出试剂，室温溶解后直接分装配制，未进⾏充分混匀及短暂离⼼，

导致⼆次实验结果偏差过⼤。这点需要注意。

4. 关于荧光PCR扩增检测仪使⽤中的问题

关于荧光PCR仪器使⽤中的问题，主要是要对所使⽤的PCR仪器充分熟悉， 在此介绍⼀下罗⽒LightCycler和ABI 7000使⽤中

曾经发⽣的2个差错。某⽤户使⽤本公司的“RT-PCR⼀步法”的丙型肝炎病毒核酸扩增（PCR）-荧光定量检测试剂盒，结果⼀

直不好，使⽤的仪器为罗⽒LightCycler，经研究发现，该⽤户是将加好反应液和核酸模板的⽑细反应管放⼊LightCycler后再

启动仪器，⽽LightCycler启动时会⾃动执⾏⼀个⾃检程序，该程序运⾏中的⼀个加热过程会破坏反应液中的逆转录酶。因

此，建议⽤户在仪器的⾃检程序运⾏完毕后，再将⽑细反应管放⼊LightCycler进⾏扩增检测。按此建议，该⽤户得到理想的

实验结果。还有⼀个⽤户将本公司的⼄型肝炎病毒核酸扩增（PCR）-荧光定量检测试剂盒在ABI 7000上使⽤时也发⽣问题，

荧光信号极低，经研究发现，该⽤户使⽤ABI 7000时，仪器的门未完全关好，荧光检测光路出现偏差，导致上述结果，经改

正后取得很好的实验结果。

5. 其它操作细节问题

由于荧光定量PCR是⼀项精度要求相对较⾼的检测项⽬，因此⼀些操作的具 体细节问题也要引起⾜够的重视。⾸先扩增管盖

⼦要盖紧，这⼀点来不得半点马虎，有⼀次我们发现某个样品扩增曲线与其它样品⼤不相同，呈⼀斜线上升且幅度不⼤，经仔

细观察是管盖没有密封好造成PCR反应液热蒸发，荧光探针浓度由于液体体积缩⼩⽽增⼤，致使荧光检测结果为⼀条“怪线”，

值得庆幸的是，该

份标本为阴性标本，否则，可能造成实验室⼤量的DNA⽓溶胶的污染。另外，压盖时由于粗⼼或者⽤⼒不均致使部分盖⼦变

形，这时貌似密封⽽实际上往往相反，应该更换新的盖⼦，不要嫌⿇烦或抱有“碰运⽓”的⼼理。PCR操作的最后⼀步是加模板、盖盖、离⼼（⽑细管）或甩⼀下（离⼼管）再上机，操作中应注意使⽤⽆荧光污染的薄膜⼿

套或⽆粉橡胶⼿套，避免使⽤带有⼤量滑⽯粉的橡胶⼿套，因为它产⽣显著的荧光背景会⼲扰正常的读数；当然，也要避免其

它含有荧光污染的物质接触到反应管。吸取经柱或磁珠抽提的模板时要先混匀模板，建议使⽤移液器来回搅动⼀次以上后（吸

头要带有滤芯）再吸取模板到反应管，这样有利于低载量标本检测获得较好的重复性。

PCR反应液⼀旦按说明书要求的⽐例配制完成并混匀后⼀般不宜放置过久，尤其是不能放置过夜，哪怕是低温如零下20度过

夜也会影响到试剂的检测灵敏度，因为PCR/RT-PCR反应液中的酶、引物、底物在低温与室温下均可按较低的效率起反应⽽

消耗部分原料产⽣⾮特异的引物⼆聚体等副产品。⼀般的建议是配制完PCR反应液后的0.5—3⼩时内应及时上机扩增，⽽加

有模板的反应液则越早上机越好，当然在⼀定的时间如半⼩时内的检测性能是毫⽆差别的。超过3⼩时对检测性能可有负⾯影

响，并随时间延长⽽影响增⼤。

使⽤负压式核酸提取柱法提取核酸是当前较先进的标本处理模式，尽管操作⽅便快捷，⼈为误差⼩，但是具体细节也要操作得

当。例如提取柱法操作的“洗脱”前⼀步是⾼速离⼼1分钟，其⽬的是将洗涤液中的⼄醇甩净（去除⼲净），因为⼄醇是逆转录

酶及Taq酶的强抑制剂，痕量的⼄醇也可抑制逆转录酶⽽使RT失败，所以该步的⾼速离⼼相当关键，不可省略。⽽某些类型

的离⼼机，计时是从按“start”键开始的，由于加速度⼩，⼀分钟过去了还没达到预设的速度，结果造成⼄醇去除不⼲净⽽导致

假阴性结果。因此我们要根据仪器的实际情况作出相应的调整。说明书中的1分钟是该指定速度下运⾏⼀分钟，所以在这种离

⼼机上操作时应适当延长时间，如设定离⼼时间为2-3分钟，以确保实验成功。

关于仪器软件使⽤时的分析不当也可造成检测结果差异乃⾄错误。由于⽬前国内的PCR扩增仪的品种较多，软件也各具特

⾊，因此要先熟悉软件的操作、仔细阅读其使⽤说明书或经专业培训后再⾏PCR定量检测分析。例如循环基数的设定，⼀般

情况下，ABI的仪器如ABI7500推荐设定为3—15，某些时候强阳性标

本Ct值在15之前，这时，就应将循环基数作适当调整，⾄少要将循环基数调到强阳性标本的Ct值之前。再如LineGene仪器的F1/F2/F3的放⼤系数，⼤多数的检测试剂盒⽬前的模式均为单波长荧光，为FAM标记，检测通道为F1，在使⽤过程中可根据

试剂的实际情况选择合适的放⼤倍数：太低则信噪⽐差，太⾼则容易溢出。另外⼀个需要注意的是仪器的⽼化问题，由于有的

仪器采⽤卤素灯作为光源⽽所有的灯泡均有⼀定的寿命，有的还较短，我们在使⽤PCR仪的过程中发现光强减弱，或者检测的荧光信号逐渐降低，此时应与仪器⼯程师取得联系，分析原因，解决问题。

科华DP－1000核酸提取仪 负压式核酸提取装置

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PCR常见问题

PCR常见问题

1．常规程序

将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。

2．复性（退火）和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。

3．反应时间

变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。

4．循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。

平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。

5．PCR反应液的配制

PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA聚合酶。

对于使用为时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A管含模板、引物和dNTP，以及调整体积的H2O，B管含缓冲液、DNA聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。

PCR结果解读

PCR结果解读

Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。

影响Tm值的因素

①DNA碱基组成:C-G含量越多，Tm值越高;A-T含量越多，Tm值越低。

②溶液的离子强度:在低离子强度中，Tm较低，而且解链的温度范围较宽;在高离子强度中，Tm值较高，解链的温度范围较窄。

③PH值:溶液的PH值在5~9范围内，Tm值变化不明显，当PH>11或PH<4时，Tm值变化明显。

④变性剂:各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低Tm值。

⑤DNA双链本身的长度。

溶解曲线相关问题：

这个一般是用SYBY Green作为荧光染料的时候需要做的工作

因为SYBY Green染料是非特异的染料只要有扩增染料就可以镶嵌在双链

中发出荧光。我们做溶解曲线是为了观察我们扩增发出荧光的片段是不是我们需

要的产物。如果溶解曲线做出来只有单峰且出锋位置是你的退火温度那么这

个是你的产物发出的荧光实验结果有效。如果出现多锋或退火温度不对那么

这个实验结果是不可信的你需要再次调整

PCR常见异常扩增曲线

PCR常见异常扩增曲线

PCR常见异常扩增曲线问题解析

在PCR反应体系中加入荧光基团，利⽤荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每⼀个循环变得“可见”，最后通过循环阈值( Cycle threshold，Ct) 和标准曲线的关系对起始模板进⾏定量分析。

PCR扩增过程中，每⼀轮循环均检测⼀次荧光信号的强度。随着反应循环次数的不断增加，所扩增的⽬的基因⽚段呈指数规律增长，反应中产生的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正比。仪器实时检测和采集的荧光信号，随着时间和循环数的不断增加，产⽣⼀条反映实时荧光信号强度变化的曲线，称为扩增曲线。

扩增曲线以循环数为横坐标，荧光强度为纵坐标。样本扩增曲线是反应PCR进程的镜⼦，我们可以通过观察扩增曲线来评估PCR扩增效率，分析实验是否顺利进⾏。扩增曲线的正常与否，反映出实验中存在的诸多因素和问题，对新冠核酸检测结果判读⾄关重要。

⼀、 正常状态扩增曲线

正常PCR扩增曲线呈“S”型，分为基线期、指数期、平台期。扩增曲线良好的指标是曲线拐点清楚，扩增曲线整体平⾏性好，基线平⽽⽆上扬现象。

基线期

PCR起始时，刚开始前几个循环的荧光信号还没有发生变化，接近一条直线，将其称之为基线，一般是3-15个循环。在基线期内，扩增的荧光信号被背景荧光信号所掩盖，无法判断PCR产物量的变化。

指数期

扩增的荧光信号高于背景荧光信号，扩增曲线起峰，开始进入指数期。在指数期内，每个循环积聚的产物准确加倍（假定100%反应效率）。该阶段的PCR反应具有高度特异性和精确度。因为所有试剂均充足，反应的动力学推动反应有利于扩增子加倍，所以产物出现指数级扩增。只有在这个阶段，Cq值与初始模板量的对数之间存在线性关系，所以在此阶段进行定量分析最合适。

线性期（高变异性）

随着PCR反应体系各成分的消耗，其中的一种或者多种成分限制反应，导致反应开始减缓，并且每个循环的PCR产物不再加倍，该阶段不再是指数级扩增。

平台期 反应停止，不再产生更多产物，并且如果放置时间够长，PCR产物将开始降解。因为每个样品具有不同的反应动力学，所以每支试管或每个反应将在不同的时间点进入平台期，最终的产物含量也各不相同。

PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案!

PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案!

第 1 页 共 3 页 PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案！

PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规章甚至消逝。

但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的推断，详细归类为以下常见的4点，描述如下：

问题一：无扩增产物

现象：正对比有条带，而样品则无。

缘由：

1、模板:含有抑制物，含量低。

2、Buffer对样品不合适。

3、引物设计不当或者发生降解。

4、反应条件：退火温度太高，延长时间太短。

对策：

1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。

2、更换Buffer或调整浓度。

3、重新设计引物（避开链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物。

4、降低退火温度、延长延长时间。

问题二：非特异性扩增

现象：条带与估计的大小不全都或者非特异性扩增带。

缘由：

1、引物特异性差。 第 2 页 共 3 页 2、模板或引物浓度过高。

3、酶量过多。

4、Mg2+浓度偏高。

5、退火温度偏低。

6、循环次数过多。

对策：

1、重新设计引物或者使用巢式PCR。

2、适当降低模板或引物浓度。

3、适当削减酶量。

4、降低镁离子浓度。

5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。

6、削减循环次数。

问题三：拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

缘由：

1、模板不纯。

2、Buffer不合适。

3、退火温度偏低。

4、酶量过多。

5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。

6、循环次数过多。

对策： 第 3 页 共 3 页 1、纯化模板。

2、更换Buffer。

3、适当提高退火温度。

4、适量用酶。

5、适当降低dNTP和镁离子的浓度。

6、削减循环次数。

问题四：假阳性

现象：空白对比消失目的扩增产物。

缘由：

靶序列或扩增产物的交叉污染。

对策：

1、操作时应当心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

2、除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。