实验二：细菌的简单染色和革兰染色
一、实验目的
1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理
1、染色原理：
细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：
革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具
1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油
、无菌牙签
2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S3
3、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液
四、实验步骤
（1）简单染色
1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察
1. 目的要求
（1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。
（2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。
（3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
2. 基本原理
（1）简单染色法
用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
（2）革兰氏染色法
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
实验三 细菌的简单染色和革兰氏
染色
实验三 细菌的简单染色和革兰氏
染色
一、目的与要求
1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌
握革兰氏染色法的步骤和关键点
3、识别细菌革兰氏染色结果
二、实验原理：
细菌的涂片和染色是微生物学实验
中的一项基本技术。
为什么要对细菌染色？细菌的细胞
小而透明，在普通光学显微镜下不易识
别，必须对它们进行染色，使经染色后
的菌体与背景形成明显的色差，从而能
更清楚地观察到其形态和结构。
用于生物染色的染料主要有碱性染
料、酸性染料和中性染料三大类。
简单染色法可用以观察微生物的形
状、大小及细胞排列状态，是微生物技
术中应用广泛，操作简便的染色法。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分
为革兰氏阳性菌(G?)和革兰氏阴性菌(G-)
两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染
色法。其原理是利用细菌的细胞壁组成
成分和结构的不同。革兰氏阳性菌的细
胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网
状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，
使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘
形成的大分子复合物保留在细胞壁内使
细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖
层薄，网状结构交联少，且类脂含量较
高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞
壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘
的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染
后细胞呈红色。
三、实验器材
1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养
24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌
种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯
草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；
2、仪器 显微镜；
3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，
擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路
哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染
色液； 细菌的简单染色步骤：
细菌的革兰氏染色步骤：涂片,干燥,
固 定,结晶紫染
色,水
洗,
碘液媒染,水 洗,乙醇脱色,水 洗,
番红复染,水 洗,干燥,镜检.
实验四 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
一、目的要求
1. 学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料
1. 菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）
2. 试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液
3. 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理
革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病理学家Christain
Gram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革染氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性菌。大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革染氏阳性菌。
革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤
1. 细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。
2. 制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
3. 初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。
4. 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
