白色念珠菌的毒力研究综述

文章编号:1005-376X(2000)08-0215-02【论 著】白色念珠菌蛋白酶与其毒力关系的研究王丹敏,韩景田,董小青,屈　野(武警医学院微生物与寄生虫教研室,天津300162) 摘要:　目的　探讨白色念珠菌蛋白酶活动与其毒力的关系。方法　采用牛奶平板法检测54株白色念珠菌蛋白酶的分泌能力,然后选择6株菌分别经摇瓶培养测定其蛋白酶活力,并以静脉内注射方式感染小鼠进行毒力试验,以小鼠平均生存时间来评价菌株毒力。结果　54株白色念珠菌全部能分泌蛋白酶,检出率为100%。动物试验表明蛋白酶活力愈高的菌株,相应小鼠平均生存时间愈短;蛋白酶活力与菌株毒力直接正相关(r=0.934,P〈0.01)。结论　蛋白酶是白色念珠菌重要的毒力因子,蛋白酶活力可作为反映其毒力的直接指标。关键词:念珠菌;蛋白酶;毒力.中图分类号:R379.4 文献标识码:ASTUDYONTHERELATIONSHIPBETWEENCANDIDAALBICANSPROTEINASEAC-TIVITYANDVIRULENCEINMICEWANGDan-min,HANJing-tian,DONGXiao-qing,etal.(DepartmentofMicrobiologyandPanasitology,MedicalCollegeofCPAFA,Tianjin300162)AbstractObjectivetostudytherelationshipbetweenCandidaAlbicansproteinaseactivityandvirulenceinmice.Methodsproteinasesecretionofthe54C.albicansstrainswasdetectedonmilk-agarplate.Sixstrainswereselectedandtheirproteolyticactivitywasdeterminedafterincubationonashaker.Thevirulencewasespressedasthemeansruvivaltimeofmice.Results　Allof54strainstestedsecretedproteinaseindicatingthatthedetectionratewas100%.Animalexperimentshowedthatthehigherproteinaseactivitywasassociatedwiththeshorteraveragesurvivaltimeofmice.Therewasadirectlypositivecorre-lationbetweenproteinaseactivityandvirulence(r=0.934,P〈0.01).ConlusionsTheseresultsindicatethatextracelluarproteinaseisaputativevirulencefactorforC.Albicans.Proteinaseactivitycanbeusedasthedirectparam-eterforvirulenceofC.Albicans.Keywords:candida;proteinase;virulence. 白色念珠菌(简称白念菌)是人体正常菌群的成员之一,也是重要的条件致病性真菌,其致病性与粘附、芽管生成、疏水性和胞外酶等有关。近年来,白念菌分泌的胞外蛋白酶逐渐受到研究者的关注。此酶又称为白念菌酸性蛋白酶(Candidaalbicansacidproteinsae,CAP),在以外源蛋白质为唯一氮源的限制性培养条件下才能诱导白念菌产生CAP。有报道表明,胞外蛋白酶在白念珠菌病发病中起重要作用[1.2]。本文对白念菌蛋白酶活力与其对小鼠毒力的关系作一探讨。1　材料与方法1.1　菌株　共54株(菌号WD01—WD54),从念珠菌病患者标本中分离来,均经假菌丝、厚膜孢子、TTC还原及芽管生成等试验系统鉴定,确定为白念菌。菌株于无菌蒸馏水中-20℃下保存备用。1.2　培养基1.2.1　YEPD培养基(%)　葡萄糖2.0g,蛋白胨2.0g,酵母粉1.0g(pH7.5)。1.2.2　YGM-牛奶培养基(%)　葡萄糖2.0g,酵母粉0.02g,KH2PO40.1g,琼脂2.0g(pH5.0);经灭菌后冷却至50℃加入无菌脱脂牛奶3%(V/V)。1.2.3　产酶培养基(%)　葡萄糖2.0g,酵母粉0.05g,KH2PO40.1g(pH5.5);灭菌后加入经过滤除菌的牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为0.2%。1.3　牛奶平板法检测白酶的分泌　将各菌株点种于YGM-牛奶平板上,37℃培养48h后,倒入适量10%三氯乙酸(TCA)进行固定后,用磷酸盐缓冲液充分洗涤。测量菌落及其周围透明圈的直径,根据两者比值的大小将所试验菌株分为高活力(A)、中等活力(B)、低活力(C)三组。1.4　粗酶液的的制备　分别从A、B、C三组中随机挑选2株,将此6株菌接种于10mlYEPD肉汤中,37℃振荡(150r/min)培养液于4000r/min离心10min,收集上清液即得粗酶液。1.5　蛋白酶活力的测定[1]　在1.2ml0.5%牛血红蛋白溶液(用0.2M,pH3.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)中加入0.3ml粗酶液,37℃水浴振荡反应1h后,加入1.5ml20%TCA终止反应;4000r/min离心10min后,取上清液用751分光光度计测275nm吸收值。蛋白酶与底物反应所得产物的1个单位的A275定义为1个酶活力单位(U)。1.6　动物试验　昆明种纯系雌性小鼠(天津市试验收稿日期:2000-03-27作者简介:王丹敏(1970-),女,讲师。215中国微生态学杂志　2000年8月第12卷第4期　ChineseJournalofMicroecology,August2000,Vol12No4动物研究中心提供)共70只,体重18～20g,随机分为7组,分别编号为对照、A、B、C、D、E、F,每组10只。将前面挑选的6株菌分别经YEPD肉汤常规培养后,经4000离心收集菌体并洗涤两次后,用生理盐水配制浓度为2.5×107/ml的菌悬液。每株菌接种一组小鼠,分别经尾静脉给每只小鼠注射菌悬液0.2ml;对照组给每只小鼠静脉内注射生理盐水0.2ml。每日观察小鼠存活情况,共计30d,以小鼠平均生存时间来评价菌株的毒力。2　结　果2.1　白念菌分泌蛋白酶情况　将各菌株点种于VGM-牛奶平板上,培养后所有菌株的菌落周围均出现清晰的透明圈,蛋白酶阳性的菌株检出率为100%。根据透明圈和菌落直径两者比值的大小,可将54株白念菌初步分为高活力(A)、中等活力(B)、低活力(C)三组,每组出现率分别为42.6%、35.2%、22.2%。2.2　白念菌蛋白酶活力与其毒力的关系结果表1。表1　六株白念菌蛋白酶活力及其小鼠毒力试验结果组别接种菌株酶活力(U/ml)死亡率(%)平均存活时间(d)死亡时间范围(d)对照ABCDEF无WD27WD18WD51WD15WD04WD39无3.382.542.051.901.810.89010010010010010090>303.95.49.711.416.520.5未知*(2～8)(2～10)(4～18)(5～20)(10～26)(9～29)注:因该组小鼠在30d内无一只死亡,故未能测短其死亡时间范围由表1可知,WD27、WD18、WD51、三菌株为高毒株,小鼠平均存活不到10d;WD15、WD042菌株为中等毒株,小鼠均在接种后4～20d内死亡;WD39则为低毒株。并且菌株分泌的蛋白酶活性愈高,其对小鼠的毒力也愈强。以小鼠平均存活时间的倒数表示毒力,将所测得的主要数据进行曲线拟合和相关分析,结果见图1。由图1可以看出白念菌的蛋白酶活力与其对小鼠的毒力呈线性正相关(r=0.934,P<0.01)。3　讨　论近几年来发现越来越多的念珠菌能分泌酸性蛋白酶。Yamamoto等[3]采用平板法检测数种念珠菌的产酶情况,发现产蛋白酶菌株的检出率由高到低依次为白念菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌,与它们的致病力强弱顺序一致。白念菌分泌酸性蛋白酶的平板检测依据酶作用底物有BSA平板法、酪蛋白平板法及牛奶平板法等[4]。前两方法均要经氨基黑等蛋白质类染料染色后才能观察到蛋白分解圈,其灵敏度要受染液浓度、染色时间及脱色程度等多方面因素影响。相比较,牛奶平板法具有不需染色、敏感性高、不易受干扰等优点。本试验采用此方法,发现54株被检菌株均能向胞外分泌蛋白酶,阳性率为100%,且高活力菌株接近占半数,此结果与不少国外研究一致[2.3]。但也有报道,只有部分白念菌菌株能产生胞外蛋白酶,有的检出率仅为16%[1,5]。检出率的差异可能与采用不同的平板检测方法存在的灵敏度差异有关,并且也与接种方法、接种量大小有关。

实用医学杂志2019年第35卷第9期TheJournalofPracticalMedicine2019Vol.35No.9光动力对白色念珠菌生物膜的作用研究进展杨倩黄力毅广西医科大学第一附属医院感染科（南宁530000）【摘要】白色念珠菌生物膜是白色念珠菌在生长过程中为适应环境附着于活组织或无活力组织表面、由菌体产生的细胞外多聚基质包裹的有致密结构的菌细胞群体，其对抗真菌药物、宿主免疫系统和环境胁迫因子等都表现出较强的抵抗力和耐受性，是临床上病原真菌感染防治的重大挑战，因此寻找新型抗菌疗法显得尤为迫切。光动力疗法（PDT）是治疗真菌生物膜感染的新策略，是近年来研究的热点，本文就PDT对白色念珠菌生物膜的相关研究作一综述。【关键词】光动力疗法；白色念珠菌；生物膜

doi：10.3969/j.issn.1006⁃5725.2019.09.037基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81260239，81472002，81860369）通信作者：黄力毅E⁃mail：liyi175@近年来，随着抗菌药物的广泛应用及免疫缺陷病患者数量增多，真菌感染是较常见的临床问题，念珠菌是最常见的真菌病原体之一，同时也是医院获得性感染的主要病原菌，而白色念珠菌感染在相关念珠菌属中的发病率最高［1⁃2］，其常寄生在人体的口腔、皮肤、肠道黏膜及阴道等部位。当宿主免疫力低下或寄居处微环境发生改变，则易导致浅表性或全身系统性感染。现有的抗真菌药物浓度对浮游态白色念珠菌有效，但对已形成生物膜中的白色念珠菌细胞无效，虽然更高的浓度可以有效地对抗生物膜，但这些高剂量往往会对宿主造成严重的副作用（肝或肾毒性），耐药率也越来越高，难以彻底根治［3⁃4］。白色念珠菌耐药性与生物膜形成有关［5］，研究表明微生物生物膜占人类所有细菌和真菌感染的80%［6］，因此开发新的抗生物膜方法显得尤为迫切，光动力疗法（photodynamictherapy，PDT）作为一种可替代传统抗菌疗法的新型非侵入性疗法，可使生物膜实质性的减少，甚至彻底的根除［7］。相关研究［8⁃11］表明PDT可以抑制白色念珠菌生物膜形成、破坏生物膜结构、杀灭生物膜内菌体以及影响生物膜相关基因的表达，从而有效灭活耐药性白色念珠菌。本文主要从以下5个方面阐述PDT对白色念珠菌生物膜作用的研究进展。1PDT的概念及作用机制PDT是光敏剂（photosensitizer，PS）在光源照射下发生激化反应引起一系列级联反应产生大量活性氧物质导致靶细胞发生不可逆损伤的治疗方法。其作用机制涉及吸收光子激发PS到其短寿命的单重态，然后经历电子跃迁到更长寿命的三重态，较长的寿命允许三重态PS与两种不同的光化学（Ⅰ型和Ⅱ型）途径之一的环境（基态）氧反应。在Ⅰ型光化学反应中，PS通过电子转移方式生成羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢等；Ⅱ型光化学反应是PS通过能量碰撞转移方式产生单线态氧。根据激发态PS所处的位置，所产生具有细胞毒性的活性氧物质，迅速诱导损伤周围环境中微生物的细胞壁、脂膜、蛋白质等，最终非特异性地杀灭微生物［12］。2白色念珠菌生物膜的形成过程及影响其形成的因素白色念珠菌生物膜形成过程大致分为4个阶段：早期（0～11h）白色念珠菌细胞以芽生孢子的形式附着于物体表面并继续繁殖；中期（12～30h）细胞分泌胞外聚合物，黏结单个真菌细胞而形成真菌团块，进而形成分散的微菌落，并逐渐融合形成生物膜的基底层；成熟期（31～72h）细胞外基质的不断产生和释放，覆盖在真菌微菌落表面直至将细胞完全包裹，同时随菌丝或假菌丝的形成，结构逐渐复杂，发育为成熟的生物膜；72h后生物膜结构发生解离，酵母相的细胞脱落下来，继续形成新的生物膜。胞外聚合物、微生物细胞表面和细胞内生物分子是影响生物膜形成的三大因素，其中胞外聚合物通过“聚合物桥接”过程克服微生物细胞与基质之间的静电排斥，从而确保微生物细胞附着或锚定到基质［7］，这一过程对细胞的初始黏附是至关重要的。3白色念珠菌生物膜耐药性及耐药机制白色念珠菌复杂的生物膜形成，使其耐药性增加。研究表明，念珠菌生物膜细胞对抗真菌药物如两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑的抗药性比浮游细胞高30~2000倍［13］。其耐药机制可能与生物膜外基质的屏障作用、生物膜内细胞生长缓慢和营养限制、相关耐药基因表达、细胞膜甾醇代谢异常、药物外排泵的上调以及持留细胞的存在等有关［14⁃16］。研究证实PDT的抗菌作用与微生物细胞是否存在抗菌药物抗药性无关［17］。4PDT对白色念珠菌生物膜的作用4.1抑制生物膜形成酵母和菌丝型细胞的发育对生物膜的形成至关重要。PINTO等［8］体外研究证实甲苯胺蓝-O（toluidineblueo，TBO）介导的PDT能够抑制生物膜的整个形成阶段。经过不同浓度（0.01、0.02、0.05、0.1mg/mL）的TBO介导的PDT处理白色念珠菌ATCC10231，通过测定在不同发育阶段（6、12、24、48h）形成的生物膜的代谢率，证1518实用医学杂志2019年第35卷第9期TheJournalofPracticalMedicine2019Vol.35No.9实上述4种浓度的TBO均可以不同程度地抑制生物膜形成，并且在生物膜的不同发育阶段都观察到这种抑制效应，其中0.1mg/mL的TBO介导的PDT可以抑制约50%生物膜形成。该研究利用光学显微镜观察比较PDT（0.1mg/mLTBO）治疗前后生物膜的变化，治疗前，12h的生物膜形成过程中，酵母和丝状体的细胞数量减少，而48h的生物膜形成呈现出更多的细胞，包括丝状体。治疗后，观察到生物膜结构中细胞数量的减少，在12和48h的生物膜形成中，丝状体完全没有细胞，而对照组中当细胞被单独照射或单独使用TBO时，形成的生物膜的形态没有改变。研究结果表明，TBO介导的PDT可以通过减少从酵母菌到丝状体的过渡过程，从而有效地减少生物膜形成，这可能是PDT抑制生物膜形成的机制之一。QUISHIDA［18］研究也得到了相似的结论，发现白色念珠菌ATCC90028不同发育阶段（24、48h）生物膜对不同浓度（80、100、120μmol/L）的姜黄素介导的PDT都是敏感的，且24h生物膜比48h生物膜对PDT更敏感。CARVALHO等［9］研究证实二氢卟酚e6介导的PDT可降低白色念珠菌ATCC10231形成生物膜的能力，当二氢卟酚e6浓度为7μmol/L，可抑制50%生物膜形成；当二氢卟酚e6浓度为20μmol/L，生物膜形成率降低了90%以上。同时，通过光学显微镜观察到酵母细胞和菌丝形成都大大减少，在生物膜结构中完全没有丝状形式，表明PDT对生物膜形成的抑制与减少芽殖酵母形式到丝状形式的转变有关，这是定植和毒力的重要阶段。DA⁃VIES等［19］体外实验证实PDT能够减少白色念珠菌生物膜形成，在室温37℃条件下，经过52.2μmol/L的咪康唑孵化2h，紧接着7.3μmol/L的四甲苯磺酸卟啉孵育30min，能量密度为58.5J/cm2的可见光照射，用XTT实验测定发现ATCC菌株（白色念珠菌MYA⁃2732、白色念珠菌MYA⁃274）及临床分离株（白色念珠菌6122/06）生物膜形成分别减少60%、46%、73%，其抑制效果均显著高于单独使用咪康唑组或四甲苯磺酸卟啉介导的PDT组。这种联合疗法为将来用于假牙和口腔表面念珠菌生物膜的治疗提供依据。KHAN等［20］探索了新型纳米金颗粒（goldnanoparticles，GNP）增强亚甲蓝（methyleneblue，MB）介导的PDT对顽固性致病性白色念珠菌生物膜的作用，用MB介导的PDT可以抑制81.9%生物膜的形成，实验证明同时结合GNP，可以增加对生物膜的抑制，其抑制率为95.4%。QUISHIDA等［21］研究证实不同浓度（175、200mg/L）的二氢卟吩e6衍生物光狄沙嗪介导的PDT均能减少白色念珠菌ATCC90028生物膜生物量，并且连续3次PDT的应用效果更明显。4.2破坏生物膜结构生物膜复杂的空间网状结构使得抗真菌药物无法直接作用于内部的真菌，其机械稳定性取决于微生物分泌的胞外聚合物的组成和数量［22］，同时胞外聚合物作为抵御抗生素和生物杀菌剂扩散的第1道防线，也限制了PS的渗透［7］。由于PDT涉及到活性氧物质的原位生成，生物膜结构上的重要元素很有可能被氧化破坏，从而削弱生物膜的完整性［23］。KHAN等［20］利用体外实验评估GNP装载MB介导的PDT对白色念珠菌ATCC90028生物膜结构的影响，用扫描电子显微镜观察，与对照组比较，实验组出现生物膜萎缩，菌丝完全破裂，并以不规则形状物质的形式聚集，导致生物膜规则空间三维结构的消失，白色念珠菌生物膜结构被MB介导的PDT破坏。CAR⁃VALHO等［9］研究证实20μmol/L的二氢卟酚e6介导的PDT可有效改变白色念珠菌ATCC10231生物膜结构，用光学显微镜观察，与对照组比较，实验组中酵母细胞和菌丝形成都大大减少，在生物膜结构中完全没有丝状形式。孙红英等［24］利用共焦显微镜检测5⁃氨基酮戊酸介导的PDT对白色念珠菌ATCC90028生物膜活性的抑制作用，计算杀菌率的变化，通过定量分析5⁃氨基酮戊酸介导的PDT对生物膜结构的破坏效果，证实其对生物膜结构有一定的破坏作用。这种破坏生物膜结构的现象，在动物模型中也得到证实，SHERWANI等［11］在雌性BALB/c小鼠背部及口腔分别建立感染白色念珠菌ATCC90028的模型，经组织病理学分析，证实单独GNP⁃MB组、GNP⁃TBO组以及GNP⁃MB和GNP⁃TBO组介导的PDT均可以减少小鼠舌背的酵母细胞和菌丝纤维的穿透，并且发现GNP⁃MB和GNP⁃TBO具有明显的协同作用，从动物模型中可见GNP能够增强PDT的抗生物膜能力，其抗生物膜作用在牙周炎和种植体周围炎等牙科感染中有特殊应用［25-26］。迄今为止，在控制牙科生物膜感染的新方法中，PDT是导致微生物耐药概率最小的一种疗法［27］。4.3杀灭生物膜内菌体生物膜本质上主要由菌细胞群体组成，PDT是一种细胞毒性治疗方法，它能引起细胞凋亡或坏死，研究证实PDT在体内外均能杀死生物膜内的细胞［22］。SHI等［10］体外研究发现经5mmol/L的ALA孵育5h，用波长为635nm、不同能量密度（50、100、200、300J/cm2）的红光分别处理白色念珠菌ATCC90028形成的生物膜，用LIVE/DEAD真菌生存试剂盒进行快速免疫荧光染色，与对照组相比，白色念珠菌ATCC90028生物膜中的细胞分别被抑制59.82%、67.95%、71.70%、74.45%。ROSSONI等［28］体外研究白色念珠菌血清型A和B的生物膜对PDT的敏感性。300μmol/L的MB孵育5min，波长660nm，能量密度26.3J/cm2的激光分别照射白色念珠菌A（ATCC36801）和白色念珠菌B（ATCC36802）形成的生物膜后，用无菌牙签将生物膜细胞刮下壁，在超声匀浆器中对于生物膜进行破坏后进行培养测定，与对照组相比，发现MB介导的PDT使白色念珠菌A和B生物膜细胞分别减少了64%和99%。CERNÁKOVÁ等［29］体外研究证实PDT抗白色念珠菌生物膜的作用是显著有效的，经1mmol/L的MB孵育1h，波长为660nm、输出功率为190mW/cm2的红色激光分别处理氟康唑敏感菌株白色念珠菌SC5314和氟康唑耐药菌株白色念珠菌CY1123形成的生物膜，能量密度为15、23、57J/cm2时，敏感菌株和耐药菌株生物膜的生存率分别为24.57%、23.46%、22.29%和40.28%、17.91%、5.89%。结合激光共聚焦显微镜观察证实以活力菌丝为主的白色念珠菌SC5314生物膜，PDT的能力受到限制，增加能量密度并没有提高PDT抗生物膜的效率，而酵母形态为主的白色念珠菌CY1123生物膜对PDT更敏感，随着能量密度的提高，PDT抗生物膜的效率显著增加。在PDT中，PS的选择对抗菌疗效至关重要，研究发现微生物细胞比哺乳动物细胞更具有明显的负电荷，阳离子PS选择性的结合，与微生物细胞的结合相对较快，而哺乳动物细胞对阳离子PS的吸收较慢［12］。4.4影响生物膜相关基因的表达白色念珠菌生物膜的1519

ＩＳＳＮ．．．．．．．．１．．．．０．．．．０．　．．２　．．．．．．．．．．．４．．．．．９．．．—５６　ＣＮ１１—２０３４／Ｔ　实验技术与管理　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　第３Ｏ卷第５期２０１３年５月　Ｖｏ１．３０　Ｎｏ．５　Ｍａｙ．２０１３　

离心淘洗技术在研究白色念珠菌中的应用　

李万杰，张俊杰　

（北京师范大学生命科学学院，细胞增殖及调控生物学教育部重点实验室，北京１Ｏ０８７５）　

摘要：离心淘洗技术是根据样品不同的密度实现样品分离。此技术能够分离不同种类的细胞，甚至是不同　时相的细胞。利用野生型（ＳＣ５３１４）白色念珠菌以及具有假菌丝表型的突变体（ｃｌａ４Ａ和ｇｒｒｌ△）为样品，经过　超声波预处理和离心淘洗收集不同的流速组分，经后续培养和血清诱导，证实离心淘洗技术能够分离得到Ｇ１　期白色念珠菌细胞，从而实现同步化。　关键词：白色念珠菌；假菌丝；离心淘洗　中图分类号：Ｒ４４６．５　文献标志码：Ｂ　文章编号：１００２—４９５６（２０１３）０５—００３７—０３　

Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　

Ｌｉ　Ｗａｎｊｉｅ，Ｚｈａｎｇ　Ｊｕｎｊｉｅ　

（Ｋｅｙ　Ｌａｂ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００８７５，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ，ｕｓｉｎｇ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ　ｃａｎ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｙｐｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｅｖｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌ　ｐｈａｓｅｓ．Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ（ＳＣ５３１４）ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈａｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（ｃｌａ４Ａ　ａｎｄ　ｇ￣ｌＡ）ｏｆ　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ａｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ，ａｎｄ　ｕｓｉｎｇ　ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ　ｃａｎ　ｃｏｌｌｅｃｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｌｏｗ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｆｔｅｒ　ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ　ｃａｎ　ｂｅ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ　Ｇ１　ｐｈａｓｅ　ｃｅｌｌｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ；ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈａｅ；ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ　

中国真菌学杂志２０１７年ｏ４月第１２卷　２魍Ｃｈｉ　Ｊ＿　ｙｃｏｌ，Ａｐ　ｒｉ１　！！　！　：　

两株白色不产孢烟曲霉形态学及毒力研究　

姜媛　张彩云　王逢源　孔庆涛　张征　曾秋琼　龙南彪。　桑红　（１．南京军区南京总医院皮肤科，南京２１０００２；２．南京师范大学生命科学学院，南京２１００４６）　・　６９　・　

论著　

【摘要】　目的将先后发现的两株白色不产孢的烟曲霉Ａｌｊ与Ａ２ｊ进行对比，观察其在形态学和毒力方面是否有差异。　方法　通过真菌基因组ＤＮＡ的保守序列ＩＴＳ和　ｔｕｂ的测序对Ａ　进行菌种鉴定；采用小培养方法在显微镜下比较ＡＩｊ、　Ａ　及标准株Ａｆ２９３的菌丝形态；观察Ａｌｊ和Ａ勿在不同培养时间和不同培养基上生长的菌落形态；在小鼠模型上测试其　毒力变化。结果通过ＩＴＳ和　ｔｕｂ的测序Ａ２ｊ被鉴定为烟曲霉；小培养发现ＡＪ　和Ａ　与标准菌株Ａｆ２９３不同，两者均　为不产孢的烟曲霉，且两者生长速度明显不同；培养不同的时间和不同的培养基均不能诱导Ａｌｊ和Ａ勿产色和产孢，但是　５ｏ℃下，ＡＩｊ被限制生长，而Ａ　却能生长；在免疫抑制的小鼠模型中，与标准菌株Ａｆ２９３相比，Ａｌｊ的毒力下降，但Ａ勿小　鼠的死亡数量、死亡速度与Ａｆ２９３相当，表明Ａ２ｊ的毒力并没有降低。结论　新发现的白色不产孢烟曲霉Ａ２ｊ与Ａｌｊ在生　长速度、耐热性和毒力方面均不同。　【关键词】烟曲霉；鉴定；孢子形成；侵袭性曲霉病模型　【中图分类号】Ｒ　３７９．６　ＩＸ献标识码】Ａ　【文章编号１　１６７３—３８２７（２０１７）１２—００６９－０５　

Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｗｈｉｔｅ　ｎ０ｎｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　

ＪＩＡＮＧ　Ｙｕａｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｃａｉ—ｙｕｎ　，ＷＡＮＧ　Ｆｅｎｇ—ｙｕａｎ　，ＫＯＮＧ　Ｑｉｎｇ—ｔａｏ　，ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｅｎｇ　，ＺＥＮＧ　Ｑｉｕ—ｑｉｏｎｇ　，ＬＯＮＧ　Ｎａｎ－　ｂｉａｏ　，ＳＡＮＧ　Ｈｏｎｇ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｊｉｎｌｉｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｒｅｇｉｏｎ，ＰＬＡ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１０００２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍ—　ｉｃｓ，Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕ－　ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００４６，Ｃｈｉｎａ）