细胞生物学中的干细胞研究

Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。

将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。

RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。

Southern杂交 一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。

扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。

细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。

免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。

电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。

Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。

细胞生物学研究中的激活剂和抑制剂

Anandika Dhaliwal Ph.D.

anandika dot dhaliwal at gmail dot com

Rutgers University, New Jersey, United States

译者

王秀英博士

mary at labome dot com

美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)

DOI

/10.13070/.3.185

日期

更新 : 2013-10-19; 原始版 : 2013-04-27

引用

实验材料和方法 2013;3:185

介绍

细胞生物学研究细胞结构、生理特性及细胞功能。它涉及到对细胞器、细胞与周围环境间相互作用、生命周期、分化及死亡的研究。细胞生物学与遗传学、分子生物学、发育生物学和生物化学等其它生物学领域是密切相关的。

图 1.真核细胞骨架。肌动蛋白纤维显示为红色，微管为绿色，核为蓝色。肌动蛋白染色使用的是罗丹明-鬼笔环肽，微管使用的是连接有Alexa488的抗α微管蛋白着色剂，DNA则使用的是Hoechst染料。

对于细胞生物学领域的研究者而言，为了更加全面地理解细胞的功能、细胞的信号传递以及控制细胞命运、功能及表型的胞内机制，抑制剂与激活剂是至关重要的研究工具。许多抑制剂和激活剂都被广泛用于研究细胞动力学及功能。这里我们对真核细胞中各种细胞生物学研究如细胞内吞、分泌、粘附、细胞骨架动力学、内质网和高尔基体研究中常用的抑制剂和激活剂进行了综述。

细胞骨架

细胞骨架为细胞提供了特定的结构与形状。真核细胞主要有三种细胞骨架纤维：1）微丝，2）中间丝和3）微管。

微丝（肌动蛋白丝）：这是细胞骨架中最细的纤维。它们由肌动蛋白亚基的线性聚合物所组成，通过在纤维一端的伸长并伴随着另一端的收缩来产生力，从而使其间的纤维产生净移动。

中间丝：这种纤维的平均大小为直径10纳米并且比肌动蛋白丝更稳定（是紧密结合的），是细胞骨架的异质成分。中间丝负责组织细胞内部的三维结构和细胞器，是核纤层的结构性组成部分。它们也参与一些细胞-细胞间和细胞-基质间的连接过程。

细胞生物学研究热点---1

细胞通讯 信号转导 增殖 调控 生长 分化 衰老 死亡 干细胞 细胞工程

1细胞通讯和细胞信号转导

高等生物所处的环境无时无刻不在变化，机体功能上的协调统一要求有一个完善的在细胞间进行反映和相互作用的机制，称为细胞通讯.在通讯过程中，细胞作为一个生命的基本单位，一个相对独立的系统，如何识别周围环境中存在的各种信号，并将其转变成细胞内各种分子功能上的变化，从而改变细胞内的某些代谢过程，影响细胞的生长速度，甚至诱导细胞的死亡.所以I}1明细胞信号转导的机制对生命活动将有着重要意义.近年来人们对信号分子受体跨膜信号转导系统及胞内信号转导途径等方面有了深人的认识，并认为细胞内存在着多种信号转导方式和途径，各种方式和途径间又有各个层次的交叉调控，是一个十分复杂的网络系统.研究结果将成为疾病机制研究(如肿瘤、药物中毒)、药物的筛选及毒副作用研究的基础.

2细胞增殖与细胞周期的调控

细胞正常的分裂、增殖、分化与衰老维持着机体自身的稳定，细胞周期的异常会导致这一系列过程的紊乱，细胞的增殖是通过细胞周期来实现的，所以研究细胞增殖的基本规律及细胞周期的调控机制，不仅是控制机体生长发育的基础，也是研究细胞癌变发生及控制的重要途径.到目前为止，已有三类细胞周期调控因子被发现，分别是细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，它们之间的相互作用调节着细胞周期的进程随着研究的深人，将会发现更多的调控因子，并对调控机制有深人的了解，继而有可能人工促进不再分裂的细胞(神经元)增殖，障碍细胞(再生障碍性贫血)及增殖失控细胞(癌细胞)恢复正常有序的增殖，这方面的研究将具有重大的理论及实际意义.

3细胞的生长和分化

使原有的细胞长大与生成更多的新细胞，是细胞生长和增殖的两个概念，也是两个不同的过程.

白质和核酸的生物合成是细胞生长的分子生物学基础，最近美国科学家发现一种名为“}}3”的蛋白质，在控制细胞生长速度方面起着关键作用，这种调节分子本身可以作为一种独特的药靶，破坏它就可以终止癌细胞的生长.另外}}3的活跃程度可反映出全身细胞的生长速度，所以斑州3可作为开发高灵敏度抗癌方法的生物标志物，这种蛋白质在引导生长信号的传递途径中的真正机制还需进一步探讨.细胞生长是细胞分化的签础，细胞分化贯穿于多细胞生命的整个过程，随着研究的深人，科学家们将分化和去分化的机制，从基因水平上进行研究，并发现在大多数生物中，其分化机制是类似的，即由基因直接控制各细胞的合成，承担起细胞分化的“开关”和“管理者”功能.在对细胞分化与癌变关系的深人研究中，许多研究证明癌细胞的诱导分化是可能的，但是，要癌细胞的逆转问题还需对细胞分化及其调控的详细机制以及分化和恶性变的关系做大量深人的研究工作，才有助于了解细胞正常分化与癌变机制.

第二章细胞生物学研究方法

细胞生物学以细胞为研究对象，从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平三个层次，以动态的观点研究细胞和细胞器结构和功能、细胞生活史和各种生命

活动。

1．细胞结构、成分的观察-显微成像技术

原理：照明系统发出的光线或电子束通过样品时，与样品发生相互作用，其被改

变的物理特征被肉眼观察或通过探测器检测而成像。分辨率：r=0.61λ/nsinα；分辨极限：一定波长的射线不能用以探测比它

本身波长短得多的结构细节。

1.1普通光学显微镜及样品制备

1.1.1各种光学显微镜普通光学显微镜

荧光显微镜：利用紫外线为光源照射样品，使之发生荧光。

相差显微镜：将不同成分的衍射系数改变为明暗变化。

暗视野显微镜：利用散射或衍射光增大反差。倒置显微镜：普通光学显微镜的倒置。

1.1.2样品制备

取材、固定（杀死细胞，稳定细胞的成分，形成一定硬度）、包埋、切片、

染色、观察。放射性自显影：放射性同位素标记、底片。

1.2电子显微镜及其样品制备

1.2.1电子显微镜

透射电子显微镜照明系统为电子束，电磁透镜调整电子束的亮度与聚焦，真空系统保护电子

枪等。

扫描电子显微镜

极狭窄电子束扫描样品，利用样品表面形成的二次电子信号成像。扫描透射电子显微镜

透射电子显微镜与扫描电子显微镜的结合：电子束扫描，透射电子成像。

1.2.2样品制备

步骤：取材、固定、包埋、切片（超薄切片）、染色（负染色等）、观察（放在载网上）。

负染色：利用重金属盐对样品进行染色，电子密度高的重金属盐包埋了样品中低

电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。

喷镀技术：以一定角度在样品的表面镀上一层金属，增强背景和待观察样品反差的方法。

冷冻断裂复型和冷冻蚀刻：生物样品在液氮中迅速冷冻，然后迅速放入冷冻装置中，并迅速抽成真空，用冰刀切割，然后观察切口表面；或将其温度稍微升高，

使样品中的冰升华，会在表面浮雕出细胞膜的超微结构。

1.3间接成像技术

扫描隧道显微镜：利用量子力学的隧道效应，探针尖端与样品表面可产生隧道电流，其值与距离呈指数变化关系。