18sRNA应用原理

RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。

2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。

深度为10-30 Million reads。

）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。

大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。

我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。

这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。

首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。

接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。

再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。

然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。

再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。

对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。

这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。

也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。

因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。

RNA 的28s/18s 指的是什么，还有，RIN怎么测定？
28s和18s是真核生物rRNA（核糖体RNA）的两个主要亚基，在体内含量较多。

RNA提取过程中可能发生各种途径的降解，28S/18S即为衡量提取的RNA完整性的指标，如果28S/18S为1.8~2.0表明所提取RNA完整性较好，基本无降解发生。

电泳条带上应是28S 在上，18S在下，且亮度为28S是18S的两倍。

RIN值的测定有专门的仪器，还可以产生RNA主要条带的峰图。

指的是核糖体RNA（rRNA). 如果跑RNA叫，这2个是亮度最强的（有时候是唯一2个肉眼可见）的条带。

28S的S是指在超速离心时的沉降系数。

都是核糖体RNA
真核生物核糖体中通常含28S、18S、5.8S和5S 四种rRNA；原核生物中则含23S、16S 和5S 三种rRNA。

S为大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可间接反应分子量的大小。

原核生物和真核生物的核糖体均由大、小两种亚基组成。

原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。

S为沉降系数（sedimentation coefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。

5S含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸。

而真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。

扩增子测序和宏基因组测序的基本原理，二者的共同点和区别全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：扩增子测序和宏基因组测序是现代生物学研究中常用的两种高通量测序技术，它们在揭示微生物群落结构、功能和多样性等方面发挥着重要作用。

两种测序技术虽然有着不同的应用领域和方法，但在一些基本原理和技术流程上也有一些共同点和区别。

下面将对扩增子测序和宏基因组测序的基本原理、共同点和区别进行详细介绍。

一、扩增子测序的基本原理扩增子测序是通过对特定DNA区段进行PCR扩增，然后对扩增产物进行高通量测序，从而揭示微生物群落的多样性和结构。

其基本原理是利用PCR技术，通过选择特定的引物对16S rRNA、18S rRNA或ITS等特定基因片段进行扩增，然后对扩增产物进行测序分析，得到微生物群落的成分和结构。

在扩增子测序中，首先需要从样品中提取DNA，然后利用通用或特异性引物对感兴趣的基因片段进行PCR扩增。

扩增产物经测序后，可以通过比对参考数据库的方法对所得序列进行分类鉴定，从而了解微生物群落的组成和结构。

扩增子测序通常能提供较高的序列覆盖度和深度，对微生物的多样性有较好的描述能力。

宏基因组测序是对整个微生物群落的DNA进行测序分析，揭示微生物群落的基因组组成和功能潜力。

其基本原理是直接对样品中的DNA进行高通量测序，然后利用生物信息学分析技术对所得序列进行注释和功能预测。

在宏基因组测序中，一个样品中包含了整个微生物群落的DNA，需要通过高通量测序技术（如Illumina、PacBio、Oxford Nanopore 等）获取大量的DNA序列。

为了减少宏基因组测序的难度和成本，通常采用元转录组测序（metatranscriptomics）或者元蛋白组测序（metaproteomics）等方法来获取微生物群落的RNA或蛋白序列。

宏基因组测序可以揭示微生物群落的基因组组成，包括编码代谢途径、蛋白质结构和功能等信息，对理解微生物群落的代谢机制和生态功能有很大帮助。

RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA，作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a)TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。

加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。

RNA存在于水样层中。

收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75％乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny配合Trizol A+提总RNA操作）1.匀浆处理（*打开离心机，降温）a)-80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。

用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10％（注：先加700μl Trizol A+，再加300μl，防止外溢；一般匀浆1.5~2min，可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3.将Phase lock Gel TM (PLG)置于离心机中，15000Xg离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml 氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。

RNA 的28s/18s 指的是什么？
28s和18s是真核生物rRNA（核糖体RNA）的两个主要亚基，在体内含量较多。

RNA提取过程中可能发生各种途径的降解，28S/18S即为衡量提取的RNA完整性的指标，如果28S/18S 为1.8~2.0表明所提取RNA完整性较好，基本无降解发生。

电泳条带上应是28S在上，18S 在下，且亮度为28S是18S的两倍。

真核生物核糖体中通常含28S、18S、5.8S和5S 四种rRNA；原核生物中则含23S、16S和5S 三种rRNA。

S为大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，即在超速离心时的沉降系数，可间接反应分子量的大小。

原核生物和真核生物的核糖体均由大、小两种亚基组成。

原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。

S为沉降系数（sedimentation coefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。

5S含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸。

而真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。

图一：胚胎发育基因表达的时空模式．．：表示起点（ｓｔａｒｔｉｎｇ曲１）；ＨＳＰＴＯ．１：热激蛋白ｆｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒａｔｅ砷；Ｕ２ａｎ，ｐ－城人Ｕ２ａｆ３５Ｋｄａ剪切因子的同源基因：Ｈ一２：组织棚溶性抗原：ｆ１２一Ｍ：Ｂ一微球蛋白ｆ口一ｍｈ：ｍｇｃ４，ａｌｉｎ）；ＦＡＧ：胚胎基因激活（Ｅｍｌｓｙｏｎｉｃｇｅｎｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）：ｅＴＦ．ＩＡ：（旧称ｅＴＦ－４ｃ）｛人转录起始因子盯一４ｃ基因的同源基因）；ＯＣｒ．：转录因子；ＨＰｉｔＴ：次黄嘌呤核精转移酶《ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ＾岫Ｉｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；葡萄糖醛酸酶：Ｇｌｕｅｔｗｏｎａｔａｓｅ；ＴＲＣ：转录必需复合物（Ｉｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—Ｔｅｑｕ确唔ｃｏｍｐｌｅｘ）；ＥＩｌ出Ａ：ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｏｎ帕ｄ０＾：ＳｒＥＥｇ：胚胎基因阶段特异性瞬时表达（ｆｌＵｔｇｅ—ｓｐｅｃｉａｌｔｉｎ．ｏｒａｌ“畔面ｄｄｍｂｆｙｏｎｉｃｇｅｎｅ）２论文研究目标根据小鼠１８ＳｒＲＮＡ保守区序列设计引物，用ＲＴ－ＰＣＲ检测其在小鼠卵巢及单个卵母细胞中表达；用ＲＴ－ＰＣＲ从单个卵母细胞获得保守区序列片段并连接至ｐＴＧｌ９－Ｔ载体，转化大肠杆菌，取阳性克隆提取质粒进行测序；对测得的１８ＳｒＲＮＡ保守区序列进行生物信息学分析，设计并合成ＲＮＡ干扰寡核苷酸片段，构建１８５ｒＲＮＡ干扰表达质粒，为进一步研究１８ＳｒＲＮＡ对小鼠卵母细胞及早期胚胎发育的影响奠定基础。

３Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒（捷瑞生物工程有限公司）ｄＮＴＰｓ（捷瑞生物工程有限公司）ＭＬＶ酶（捷瑞生物工程有限公司）异戊醇（天津广成化学试剂有限公司）ＲＮＡ抑制酶（捷瑞生物工程有限公司）ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｅＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ＃Ｋ１６２１Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ５ｘｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（捷瑞生物工程有限公司）１．１．４引物设计联网进入美国国立生物技术信息中心网站（ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／），输入小鼠“ｍｏｕｓｅ１８ＳｒＲＮＡ”检索其核酸序列，详见附录１。

PCR技术在中药鉴定中的应用[摘要]以聚合酶链式反应（PCR）技术为支撑的现代分子生物学技术，包括随机扩增多态性DNA（RAPD）技术、ISSR-PCR 技术、PCR-RFLP 技术、mRNA 差异显示技术、基因测序技术及基因芯片技术在中药鉴定中的应用，现代分子生物学技术的蓬勃兴起将极大地推动中药鉴定的发展。

[关键词] PCR 技术；分子生物学技术；中药鉴定千百年来，中药在维系国人的身体健康方面发挥了不可替代的作用。

中药包括植物药、动物药和矿物药，品种繁多，加之各地的用药品种和用药习惯不尽相同， 同名异物和同物异名现象屡见不鲜。

为规范药材市场、鉴定中药真伪优劣，确保中药的质量与疗效，建立一套准确、简捷、迅速的鉴定方法迫在眉睫。

近年来分子生物学的发展突飞猛进，特别是聚合酶链式反应（PCR）技术的问世，推动分子生物学的各个领域向纵深发展[1]。

基于 PCR 技术的现代分子生物学操作在中药鉴定中得到应用，以其独具的准确性和可靠性，弥补了传统中药鉴定中的许多不足，展现出其他方法难以比拟的优势。

本文以 PCR 技术为切入点， 着重介绍目前在中药鉴定中运用较多的几种分子生物学操作技术，希望能够抛砖引玉，合众人之力增加中药鉴定中的现代元素，推动中药鉴定方法的改进与革新。

1 PCR 技术概述PCR 技术由美国 Karray 等学者于 1985 年首创， 并由美国 Cetus 公司开发研制。

PCR 技术原理是根据已知 DNA片段序列， 人工合成与该 DNA 两条链末端互补的寡核苷酸引物，在酶促作用下将待检 DNA 序列进行体外扩增。

PCR 反 应 体 系 基 本 成 分 包 括 模 板 DNA （ 待 扩 增DNA）、引物、4 种脱氧核苷酸 （dNTPs）、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的原理类似于 DNA 的天然复制过程。

在待扩增的 DNA 片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。

28s与18s分子量28s与18s分子量是指在核糖体RNA中28s rRNA和18s rRNA的分子量。

核糖体RNA（rRNA）是一种在细胞中参与蛋白质合成的重要分子。

28s rRNA和18s rRNA是核糖体的两个重要组成部分，它们的分子量反映了它们在蛋白质合成中的作用和功能。

28s rRNA和18s rRNA的分子量可以通过实验方法进行测定。

一种常用的方法是通过凝胶电泳分析。

首先，将核糖体RNA提取并进行适当的处理，然后将其加载到琼脂糖凝胶上，施加电场使RNA分子在凝胶中移动。

根据分子量的不同，28s rRNA和18s rRNA会在凝胶上形成不同的位置带，通过与已知分子量的标准品进行比较，可以确定28s rRNA和18s rRNA的分子量。

通常情况下，28s rRNA的分子量大于18s rRNA的分子量。

具体数值会根据不同物种和细胞类型而有所差异。

对于大多数真核生物，28s rRNA的分子量约为2.9-3.5 MB（兆碱基），18s rRNA的分子量约为1-2.5 MB。

这些数值是根据实验数据估算得出的，并且会因为不同的实验条件和分析方法而有所差异。

28s rRNA和18s rRNA在核糖体中有着不同的功能。

18s rRNA存在于核糖体的小亚基中，起到识别mRNA起始位点和帮助形成蛋白质的核心结构的作用。

28s rRNA则存在于核糖体的大亚基中，参与tRNA的结合和蛋白质的合成。

总之，28s与18s分子量是指核糖体RNA中28s rRNA和18s rRNA 的分子量，通过实验方法可以确定它们的分子量，并且它们在核糖体中有着不同的功能和作用。

这对于了解核糖体的组成和蛋白质合成的机制非常重要。