第46卷 增刊1厦门大学学报(自然科学版)V ol.46 Sup.1 2007年8月Journal of Xiam en U niversity (Natural Science)A ug.2007纤毛虫摄食对浮游植物光合色素降解规律的初步研究田皓洁,胡 俊,陈纪新,柳 欣,黄邦钦*(厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室,环境科学研究中心,福建厦门361005)收稿日期:2007-06-11基金项目:国家自然科学基金(40331004,40376043)资助*通讯作者:bqhu ang@x 摘要:在实验室培养条件下,运用基于H PL C(高效液相色谱)的色素分析技术,以叶绿素a 和主要类胡萝卜素的降解产物为指示,研究了海洋纤毛虫摄食微藻过程中对光合色素降解的影响以及降解规律.研究发现了对纤毛虫摄食活动有潜在指示意义的特征指示色素P heo phor ibide a 2.纤毛虫与桡足类对浮游植物的摄食过程对被摄食者色素降解影响规律不同.纤毛虫摄食过程对叶绿素a 的降解效率显著低于桡足类摄食过程,且不存在对类胡萝卜素的降解偏好性.关键词:纤毛虫;降解规律;特征色素中图分类号:Q 959.11 文献标识码:A 文章编号:0438-0479(2007)S1-0144-05 随着微食物环理论的提出,纤毛虫在海洋生态系统的物质循环和能量流动中的作用显得更为重要.浮游植物特征光合色素是包括各种物理与化学性质差异很大的一类化学物质.按结构可以分为3类:(1)叶绿素类,包括叶绿素a,b,c,d 及其的降解产物;(2)类胡萝卜素类;可分为胡萝卜素和叶黄素;(3)藻胆蛋白类,藻胆蛋白是蓝藻的特征色素,包括藻红蛋白(Phy -coerythrin,PE),别藻蓝蛋白(Phycoer ythr ocy anin,PEC)和藻蓝蛋白(Phy cocyanin,PC)等.作为生物标志物,光合色素被广泛地运用于指示浮游植物的生物量、类群组成以及真光层碳流输出.近几年利用光色素在指示浮游动物摄食活动方面的研究也非常活跃.国外关于该方面的研究大多以海洋桡足类作为研究对象[1-5],取得了一定的进展,并有相关模型提出[6-8].但以原生动物为研究对象的只有零星报道[9-10].本文以台湾海峡南部海区分离出的纤毛虫为研究对象,在控制条件下探讨纤毛虫摄食过程中浮游植物各种光合色素的降解产物及降解规律以及是否存在可以指示摄食活动的特征光合色素,为能否将该规律运用于现场海域积累数据.1 材料与方法1.1 分离与培养实验所选用的海洋纤毛虫为扇形游仆虫(Eu -p lotes vannus ),分离于台湾海峡水样中,于实验室环境下培养驯化.所用藻类为盐生杜氏藻(Dunaliella salina ),为本实验室保存种的藻类.1.2 摄食过程光合色素的降解实验所有所用容器用10%的H Cl 浸泡后,用Mill-i Q 水涮洗后烘干.培养海水和f/2培养基确保无菌.实验瓶(内盛摄食者和藻液)为1L 的锥形瓶(15个),含有600mL 的培养基,而对照组(只含藻液)为500mL 的锥形瓶(15个),含有300mL 的培养基.所有锥形瓶置于21?2e ,14light Ø10dark 的光周期下培养(光照度4000lx ),藻液初始浓度1000个/mL,摄食者密度2个/m L.所有实验瓶中藻液浓度和摄食者密度通过同一次接种计数而保证一致.从加入摄食者培养开始计时,每隔24h 采样,且采样后的锥形瓶弃置,不再进行第2次采样,避免污染.1.3 测试参数及数据处理实验持续15天,期间每隔24h 进行如下处理.每次取样140mL,其中100m L 分成2个平行样用于色素分析;另外40mL 加Lugol 试剂使最后固定浓度为4%,用于计算纤毛虫丰度(采用20e ,10000r/min,10min 离心后吸去上清液计数).过滤前用10L m 筛绢预过滤,滤液于低压下抽滤到25mm 的GF/F 膜用于分析藻类细胞色素组成分析.用过滤海水冲洗筛绢而且把冲洗下来的液体抽滤到25m m 的GF/F 膜用于纤毛虫体内色素组成含量分析.对照组每次取样100mL,分成2个平行样直接过滤到25mm 的GF/F 膜,用于分析藻类细胞色素组成分析.用于参照同时期的色素情况.滤膜对折后置于锡箔袋中,于-80e 冰箱中保存.待分析的滤膜从冰箱取出后,吸干水分,剪碎置于5mL 包有黑色胶布的离心管中,立即加入3mL 二甲基甲酰胺(DMF)试剂混匀,于-20e 萃取.1h 后,将提取液离心(6000r/m in,5min),提取上清液并用GF/F 膜进行过滤以去除细胞碎屑和其他细微颗粒.按V(滤液)ØV(酸酸铵)=1Ø1混合于色谱瓶中(其中醋酸铵浓度为1mo l/L)待色谱分析.整个处理过程在暗条件下完成.光合色素的分离和定量按陈纪新等[11]报道的方法进行.所有的色素都吸收光但是只有叶绿素和它的降解产物可以产生荧光,所以采用2种检测器.叶绿素(除了Chl a)及其降解产物由荧光色谱法来定性定量而叶绿素a 和类胡萝卜素由吸收光谱定量定性.通过比较对照组和添加纤毛虫组,纤毛虫体内和藻液的光合色素组成及含量差别指示浮游动物摄食对色素降解的影响.1.4 叶绿素光降解和酸降解实验用商品化的叶绿素配成2L g /mL 的溶液分别置于光照度4000lx ,14lig ht Ø10dark 的光周期下24h;1.0m ol/L 的盐酸处理.采用上述方法检测其降解产物.1.5 计算方法:C p =A p f p V ext 103/V inj V filt B,其中C p :色素浓度(单位ng /L);A p :峰面积;f p :换算系数;V filt :过滤样品体积;V ext :萃取样品体积;V inj :进样体积;B:缓冲液系数.%D ={1-[(P t -P 0)/(C 0-C t )]@100,其中P t 、P 0:0、t 时刻总的叶绿素降解产物浓度;C 0、C t :0、t 时刻总的叶绿素浓度.2 结 果2.1 纤毛虫体数目变化实验期间,前8天因食物充足,纤毛虫种群生长呈逻辑斯缔增长曲线,最高值达776ind/mL.从第9天开始密度下降,但是在第10天有所回升,这可能是在计数时只计数比较完整的纤毛虫个体所带来的误差.笔者认为完整细胞才是存活个体,因为纤毛虫个体在死亡后细胞将分解,但降解可能存在滞后效应,当纤毛虫群体发生巨大变化时,可能会导致细胞丰度在计算上会存在一定误差.在后期,由于饵料不足,导致纤毛虫种群丰度急剧下降(图1).2.2 光合色素的降解(1)类胡萝卜素降解的特异性实验表明,该种纤毛虫对类胡萝卜素等光合色素图1 实验条件下的纤毛虫生长曲线 Fig.1 G row th -cur ve of ciliates图2 类胡萝卜素浓度变化a.B 胡萝卜素;b.叶黄素;c.新黄素;1.对照组;2.实验瓶藻液;3.虫体Fig.2 T he chang es o f carot eno id co ncentration降解特异性不明显(图2),所检出的主要光合色素(B 胡萝卜素,叶黄素,新黄素)的浓度变化规律基本一致.这可能是由纤毛虫摄食习惯导致藻体被囫囵吞下,各种色素在体内由于虫体酸性环境以及相关酶#145#增刊1 田皓洁等:纤毛虫摄食对浮游植物光合色素降解规律的初步研究图3 Chl a 的降解效率1.对照组;2.实验组藻液;3.虫体Fig.3 T he deg radatio n efficiency of Chl a(如色素脱色酶)的相互作用下,色素发生酸化降解.但是它们的浓度存在着较大差异,如叶黄素比其他2种高2个数量级.这种差异可能是由藻体细胞中各种色素含量本身存在差异导致.而它们在对照组、实验组中的浓度变化规律表明,纤毛虫体内酶系对这几种光合色素不具有降解特异性.显然,虽然类胡萝卜素在实验过程中可被大量稳定可持续性检出,但是由于纤毛虫对它们不存在降解特异性,因而它们不能用作指示纤毛虫摄食过程.表1 Chlo ro phyll a 的不同降解产物T ab.1 T he deg radation compounds of chlo ro phy ll a 色素名称保留时间/min最大吸收峰Pheophor ibide a 6.909420/512/609/660Pheophor ibide a 1 4.916404/510/668Pheophor ibide a 28.075412/508/612/668Pheophor ibide a 38.567408/514/618/6704(2)叶绿素a 的降解效率Chl a 性质不稳定,易酸化或光解而脱镁脱脂成为降解产物,甚至进一步降解成为无色的不可检测出的物质.所以摄食活动以及光辐射都可以导致Chl a 明显的发生降解.Chl a 的降解效率如图3所示,可以发现,Chl a 在对照组中的降解效率在培养后期当藻类开始衰亡时变高,这也许是由于藻的大量死亡导致叶绿素a 的加速降解引起.而实验组藻液中和虫体的Chl a 降解效率由于摄食者的加入,在前期(一直保持在70%以上)明显高于对照组,而后期因为纤毛虫丰度的下降,摄食量减少,由于摄食引起的降解作用减少,降解效率急剧下降.而虫体中的降解效率在第10天骤降,这是因为这天纤毛个体活性因食物的不充裕图4 实验组与对照组Chllide a/Chl a 的比较(1)对照组;(2)实验组Fig.4 T he co mpar ison of Chllide a/Chl a in the contro lbottles and experimental bo ttl而受抑制,所以出现Chl a 降解效率不高现象.(3)摄食产生的特征色素Chl a 极不稳定,不同条件下降解产物是多元的,通过实验排除了因为光照、酸化等简单理化因子的改变而产生的色素降解产物,在实验组的藻液和虫体的样品中,在连续可检测的情况下,发现在8m in 左右产生与Pheophoribide a 具有相似特征吸收但吸收值不完全吻合的特征峰Pheopho ribide a 2,该峰可能是由于摄食而导致的特征峰(表1).而Pheo phoribide a 4则在光照、酸化处理也会产生,所以它们不是该种纤毛虫的摄食作用下产生的特殊降解产物.Pheopho r-i bide a 1、Pheo phoribide a 3则未能在实验瓶所有样品中都可以检测出,因此也不能指示该种纤毛虫对藻类的摄食.3 讨 论实验表明,扇形游仆虫在摄食盐生杜氏藻过程中,会不断产生脱镁叶绿素、脱酯叶绿素或脱镁脱脂叶绿素.而且Pheopho ribide a 2可能是指示该摄食途径的特征色素.根据大量的研究表明,中型浮游动物会产生特征性的脱镁脱脂叶绿素,但与原生动物产生的会不同,这是它们不同的消化酶而导致的.M ay za -ud [12]、Nilsson [13]曾做过海洋桡足类和纤毛虫T etra-hy mena 的消化酶的比较,它们只有较小的差异,大部分糖酶和蛋白酶都是相同的.桡足类肠道和纤毛虫消化液泡都是偏酸性,但是它们摄食和消化系统在形态学上有很大不同.藻类细胞被桡足类摄食是以破碎的形态,而纤毛虫是以完整的形态吞噬整个细胞.即使没有摄食者存在的情况下,藻类细胞的机械破碎,也会导致叶绿素的降解[14-15],而且消化过程中的破碎#146#厦门大学学报(自然科学版) 2007年会提高降解酶的活性.纤毛虫的消化液泡内容物排出是随时间随机的[16],而桡足类则是一个连续的消化道,与时间是有明显相关性的.摄食者消化结构的差异在海洋摄食者对色素的降解过程中,与理化因子的重要性是同等的.与所报道的关于桡足类Pheophytin aØPheo-phorbide a的比值(0.13~1.00)[17-18]相比,纤毛虫该比例(0.348137~ 5.737442)偏高.在纯化学降解中, Pheo phytin a是形成Pheophorbide a的中间产物,如果消化降解该结论也成立,我们可以认为纤毛虫比桡足类对Chl a的降解效率要低.纤毛虫对色素的转化效率在实验后期也显得比较低(图4),这也许是由消化效率的降低引起的.根据目前的数据,我们无法判断再次摄食是否在该实验中存在以及扮演了何种角色,它是否影响了实验结果.大量研究表明,桡足类对色素降解程度与食物浓度有关,而Capriulo和Deg an[19]则发现对于海洋纤毛虫Fabr ea salina的消化时间和食物浓度之间物明显相关性.而Verity[20]则发现2种海洋砂壳纤毛虫的吸收效率和食物浓度有着相关性.如果消化而引起的变化是导致转化效率降低的主要原因,那么在实验前期食物浓度很高的情况下,转化效率发生如此大的变动就可以得到合理的解释.有研究认为,桡足类对类胡萝卜素的降解存在偏好性,而我们的结果却发现对于纤毛虫而言,这种偏好性几乎不存在.而很多研究发现,桡足类和藻类的不同选择会导致色素不同的降解速率,所以在该实验中,笔者选用的单一藻种和单一纤毛虫可能会使实验结果造成偏差,这也是随后实验中所要解决的问题.桡足类的发育状态也会导致色素降解规律的变化,而光强变化会引起纤毛虫生理变化[21],所以光度以及摄食速率是否影响了实验结果,目前无法给出肯定的答案.至于纤毛虫CBE(叶绿素脱色酶)是否与摄食速率具有相关性以及是否能提出相关的模型,有待于进一步的研究.参考文献:[1]Bustillo s Guzm n J,D L pez-Co rt s,M athus M,et al.Dynamics of pig ment deg radatio n by the copepo dite stag e of pseudodiaptomus euryhalinus feeding o n T etraselmis suecica[J].M ar Biol,2002,140:143-149.[2]M cL ero y Etheridge S L,M cM anus G B.Fo od type andconcentr ation affect chloro phy ll and caro teno id destr uc-tion dur ing co pedpo d feeding[J].L imnol O cenog r,1999,44(8):2005-2011.[3]K leppel G S.T he fate o f the carot eno id pig ment fuco xan-thin during passag e t hr ough thecopepo d g ut:pig ment re-co ver y as a function of copepo d species,seaso n and fo od concentr atio 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