拉曼光谱在生命科学领域的应用

Y(um)
Y(um)
5 um
5 um
X(um)
X(um)
图 5 骨组织拉曼分布，红色部分为新生骨（胶原），绿色部分为成熟骨（羟磷灰石+有机质)。（感谢 Robert Fleming, University of Eindburgh 提供的数据）
3. 药物
在药物配方中，通常除了有效成分之外，还包含很多辅料。而原料和辅料的分布对药物 的溶解、吸收等一系列效应有着重要影响。根据拉曼光谱中不同成分信息的提取可以得到药 片成分分布的图像，如图 6。通过一些新的成像技术，如 SWIFTTM 高速共焦光谱成像配合 DuoScan 的应用，可以在短时间内对整个药片进行成像分析。
Scores on PC 1
Cross Validation, measured vs predicted
120
115
R2 = 0,9647
110
105
100
95
90
85
80
27
80
85
90
95
100
105
110
115
120
M e asur e d
图 7 透射拉曼分析结果。左图：主成分定性分析结果；右图：偏最小二乘法定量分析结果
HORIBA Scientific 共焦拉曼光谱仪因其灵敏度高、性能优越而被广泛用于生命科学领 域的研究，在诸如基础研究、生物医学、药物、化妆品以及食品中都有着广泛的应用。
1. 基础研究
基础研究包括组织结构及成分鉴别（脂类、蛋白质、糖类、水、DNA，RNA 等）、细胞 的定位、鉴别及分类等。
生物大分子中，蛋白质、核酸、磷脂等是重要的生命基础物质，研究它们的结构、构象 等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。拉曼是分子的“指纹图谱”，生 物分子的指纹区主要出现在 100-2000cm-1，如图 1 左。拉曼对分子所处的环境非常敏感，结 构上的些微差异都能在拉曼谱图上体现出来，如图 1 右[1]。
图1 左：甲状腺肿和恶性肿瘤的拉曼谱图；右：不同肌红蛋白拉曼谱图
细胞是生命最基本的组成，是一切生命现象的基 础。共聚焦显微拉曼光谱的发展对原位活细胞研究有 着重要意义，对于小尺寸的样品，如尺寸仅仅为 1~2µm 的细菌，通过真共焦的良好共焦特性，依然可以对其 进行详细研究。如图 2 即是对细菌做的三维拉曼成像，
拉曼光谱可以从分子水平提供信息，这对于很多疾病的研究有着重要的意义。不同病变 会在拉曼谱图中有不同的特征显示，通过拉曼光谱能够对不同疾病进行判断，如图 4 中甲状 腺肿、腺瘤和甲状腺癌的拉曼光谱之间就有着很大的差异。
甲状腺肿
腺瘤
甲状腺癌
Intensity (a.u.) Intensity (a.u.) Intensity (a.u.)
600
800
1000
1200
1400
1600
Wavenumber (cm-1)
图 4 不同甲状腺病变的拉曼光谱（感谢法国兰斯大学 Manfait 教授及其同事提供的数据）
对于骨组织的愈合过程，由于新生骨的骨胶原含量更高，且与成熟骨存在成分上的差异， 所以拉曼可提供新生骨和成熟骨的分布，如图 5，从而可以判断骨组织的愈合程度。如果对 愈合过程的不同时间阶段进行拉曼分析，还可以对愈合过程进行实时监测。
由于拉曼光谱是无损的检测方法，它还可以用于药物与细胞之间相互作用的研究。如药 物与细胞作用的位点、在细胞中的分布、药物在细胞内的动力学研究等等。因此，拉曼光谱 也在药物的筛选等工作中有着广泛应用。图 8 是药物作用于细胞后的拉曼成像结果，其中绿 色是纯药物的分布位置，紫色、蓝色和粉色分别是药物作用于细胞膜、细胞质和 DNA 形成 复合物后的成分分布图。最后一张是所有成分分布的叠加。
越来越关注食品安全这个与健康密切联系的议题。拉曼
光谱作为一种无需样品前处理、灵敏度相对较高、分析
测试快速便捷的绿色光谱技术，对于食品质量检测[2]、
1#
食品中细菌鉴别[3]及食品加工[4]等都有重要应用。
很多同类食品的结构非常相似，如食用油都是脂肪 酸，但是动物食用油主要是饱和脂肪酸，而植物油主要 是不饱和脂肪酸。对于这些结构相似的化合物，使用化 学计量学方法可以有效地将它们区分开，如图 11 中的硬 脂酸甘油酯，1#样品含不饱和脂肪酸甘油酯，而 2#样品 是饱和脂肪酸甘油酯，两种样品各取 6 个点，经主成分 分析法归类后发现，拉曼可以区分开这两种非常相近的 样品。
14
20
0.46
16 0.44
25
18
1祄
0.42 2祄
20
0.40
-30
-20
-10
0
10
20
X (um)
-15
-10
-5
0
5
10
15
X (um)
0
-10 20
10 Y (祄) 0
0 X (祄) 10
-10 20
图 10 化妆品乳液拉曼成像（感谢某知名化妆品品牌提供的数据）
5. 食品
苏丹红、三聚氰胺、瘦肉精等一系列事件迫使人们
0 1 000
2 000
3 000
Y (µm)
4 000
5 000
6 000
7 000 0
2 000
4 000
6 000
8 000 X (µm)
10 000
12 000
14 000
400 µm 16 000
图 6 药片不同成分的拉曼成像，单点采集时间为 1ms，共 48081（341×141）个数据点，成像时间 535s。
Y (um) Y (um) Intensity (cnt) Intensity (counts)
-12
0.72
-25
-10
0.70
-20
-8
0.68
-15
-6
0.66
-4 0.64
-10
-2
0.62
0
-5
0.60
2 0.58
0 4 0.56
5
6 0.54
8 0.52
10
10 0.50
15
12
0.48
药物
细胞膜和细胞器 极性细胞质
药物-DNA 复合物
2 µm
各成分叠加图
图 8 药物与细胞的相互作用分布图，前 4 张图从左到右分别是纯药物、药物与细胞膜、与细胞质、与 DNA 形成复合物的分布图，第 5 张是前 4 张图的叠加。
4. 化妆品
大部分化妆品是直接和人体接触的，它们的安全性以及效果备受人们关注，无损的实时 检测更是对此行业有着重要意义。
图 3 多元分析对三种不同菌种的分类，其中 a、 b、c 分别代表三种不同细菌的训练数据，而粗 体的 a、b、c 代表测试数据（感谢英国 CEH Oxford 的 Wei Huang 博士提供的数据）
2. 生物医学
拉曼光谱在生物组织与疾病中的研究非常广泛，涵盖了几乎所有的软组织和硬组织，如 脑组织、肺组织、肝组织、骨组织等。在很多空腔组织如肺、胃、结肠等中，可以将光纤包 埋在内窥镜中实现拉曼光谱的活体实时检测。
Scores on PC 2 Cross Validation Predicted
2,5 2
1,5 1
0,5 0
-0,5 -1
-1,5 -2
-2,5 25
PCA plot - PC 1 vs PC 2- capsules
Capsules form 1 Capsules form 2
25,5
26
26,5
2#
图 11 不同饱和度脂肪酸甘油酯的 主成分分析结果
2007 年美国发生多起猫、狗宠物中毒死亡事件，经拉曼研究分析发现猫粮中的三聚氰 胺和三聚氰酸可以在肾组织中形成复合物晶体，阻塞肾小管内腔，量多严重者可致死。图 12 是猫服用三聚氰胺、三聚氰酸添加猫粮后在肾中形成复合物晶体的拉曼分析结果[5]，A 是 猫肾显微图像，B 是肾中形成的结晶，其中黑色框是拉曼成像位置，C 是成像区域的拉曼图， D 是伪彩色显示的拉曼强度分布图，E、F 是体外模拟实验得到的复合物拉曼谱图和显微图。
小结
拉曼光谱作为一种无损无标记的分析方法，它能够从分子层面对生命科学领域的样品提 供丰富的信息。共聚焦技术、新的成像方法为此项技术在生物领域的应用提供了坚实的技术 支持。近年来国内外研究者将拉曼光谱应用于细胞药物处理、细胞水平疾病诊断、单细胞生 命活动监测、亚细胞结构等研究，取得了不同程度的进展。随着研究的深入,拉曼光谱分析 技术必将在于细胞，癌症研究、细胞分选、药物筛选、食品安全等生命科学领域大有作为。
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
600
800
1000
1200
1400
1600
Wavenumber (cm-1)
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00 600
800
1000
1200
1400
1600
Wavenumbe.10 0.05 0.00
由于拉曼光谱无侵入无损伤，可直接对志愿者的皮肤进行检测研究，能够实时的监测产 品效果。通过共聚焦拉曼光谱仪可以对皮肤含水量进行深度分析，如图 9 所示，在不同深度 处皮肤的含水量不同，并且在涂抹保湿霜后在不同深度有不同的变化。由此可以判断保湿霜 的效果。染发护发产品的穿透效果深受各大品牌关注。将拉曼光谱应用于产品作用于头发的 效果研究，可以通过产品的特征谱带追踪产品的穿透深度，从而对产品的效果进行判断。
参考文献：
[1] Filip Tintchev et al. Molecular effects of high-pressure processing on food studied by resonance Raman. Ann. N.Y. Acad. Sci, 2010, 1189, 34-42.