核酸含量测定(精)

一、实验目的1. 掌握核酸含量测定的原理和方法。

2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸含量测定中的应用。

3. 通过实验操作，提高实验技能和数据分析能力。

二、实验原理核酸是一类重要的生物大分子，包括DNA和RNA。

核酸含量的测定对于生物学研究具有重要意义。

本实验采用紫外分光光度法和定磷法两种方法测定核酸含量。

1. 紫外分光光度法核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，在紫外光照射下具有特定的吸收峰。

通过测定核酸溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出核酸含量。

2. 定磷法核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为5%，DNA中含磷量为9%。

通过测定核酸溶液中磷的含量，可以推算出核酸含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料核酸样品、标准核酸溶液、标准磷溶液、定磷试剂、浓硫酸、蒸馏水、移液管、容量瓶、试管、紫外分光光度计、电炉、水浴锅等。

2. 实验仪器紫外分光光度计、电子天平、移液器、试管架、试管、烧杯、滴定管、酒精灯、玻璃棒等。

四、实验步骤1. 紫外分光光度法测定核酸含量（1）配制核酸溶液：准确称取一定量的核酸样品，用蒸馏水溶解并定容至一定体积。

（2）测定吸光度：取一定量的核酸溶液，在特定波长下测定吸光度。

（3）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。

2. 定磷法测定核酸含量（1）配制核酸溶液：同紫外分光光度法。

（2）消化：将核酸溶液加入浓硫酸，在电炉上加热至有机物分解，冷却后定容。

（3）测定磷含量：取一定量的消化液，加入定磷试剂，在特定波长下测定吸光度。

（4）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。

五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定核酸含量根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。

2. 定磷法测定核酸含量根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。

六、实验讨论1. 实验过程中，应注意避免核酸样品的污染，保证实验结果的准确性。

2. 紫外分光光度法和定磷法各有优缺点，在实际应用中可根据具体情况选择合适的方法。

DNA的定量和纯度测定
实验目的：
学习并掌握紫外分光光度法和定糖二苯胺显色法பைடு நூலகம்
测定DNA含量和纯度的基本原理
DNA测定的方法原理

紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs 相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可 进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为 1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。） 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（核酸的磷酸部分）


二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的 糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷 酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基 -γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在 595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光 吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛， 可以提高反应灵敏度。
实验内容

DNA：1ml SC溶液溶解上次提取的DNA样品，然后转移到 50ml离心管中，用9ml0.01M NaOH溶液溶解。 A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释 倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为 100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果） 核酸含量（ug/ml）=样品A260X稀释倍数/0.02 (0.022) A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为 2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中 混有蛋白质，则比值小于1.8。

一、实验目的1. 掌握定磷法测定核酸含量的原理与方法。

2. 学习核酸提取、纯化及定量测定的基本操作。

3. 了解实验数据的处理与分析方法。

二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，由核苷酸单元组成。

本实验采用定磷法测定核酸含量，其原理如下：1. 核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为10%，DNA中含磷量为8%。

2. 用强酸将核酸分子中的有机磷消化成为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵。

3. 在还原剂存在的情况下，Mo6+被还原成Mo4+，与试剂中的其他MoO42-结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8，形成蓝色化合物，称为钼蓝。

4. 在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可通过比色法测定核酸含量。

三、实验器材与试剂1. 实验器材：- 粗核酸- 克氏烧瓶（50ml）- 小漏斗（4cm）- 容量瓶（100ml、50ml）- 吸管- 试管（X18cm）- 722型或XX型分光光度计- 电炉- 水浴锅2. 实验试剂：- 标准磷溶液：将磷酸二氢钾于100℃烘至恒重，准确称取溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol/L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升含磷400μg。

临用时准确稀释20倍。

- 定磷试剂：17%硫酸：17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。

2%钼酸铵溶液。

四、实验步骤1. 核酸提取：取一定量的粗核酸，加入适量的水，用玻璃棒搅拌，使核酸充分溶解。

然后加入一定量的强酸，使核酸分子中的有机磷消化成为无机磷。

2. 核酸纯化：将消化后的核酸溶液通过离心、沉淀等方法进行纯化。

3. 核酸定量测定：a. 准备标准曲线：取一定量的标准磷溶液，分别加入定磷试剂，制备标准曲线。

b. 样品测定：取一定量的纯化后的核酸溶液，加入定磷试剂，制备样品溶液。

在分光光度计上测定样品溶液的吸光度，通过标准曲线计算出样品中核酸含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：根据标准磷溶液的浓度和吸光度，绘制标准曲线。

核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。

常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。

核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。

RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。

小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。

测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。

当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。

蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。

若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。

不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。

从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。

纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。

当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。

RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。

pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。

本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。

[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。

3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。