ELISA原理和实验

实验步骤（以处理小鼠血清样品为例）：通用版

血清处理：将收集的小鼠血液样品室温静置 40min~1h 后（不要超过 1h），放在冰上待处理（不要超过 4h），或者及时离心处理。静置待血液析出血清后，

3000rpm （1000g）， 4℃，10min 离心，离心后应呈现上层为无色或淡黄色透明血清，下层为凝集的红色血团。若上层血清呈现淡粉色或红色，则表示该血液样本溶血，血清颜色越深则表示溶血程度越高。吸取血清时若不小心吸到下层红色部分，则沿壁缓慢打回原 EP 管，过度机械损伤会造成溶血。用 1.5mlEP 管，可按吸出的血清量加入等体积的 0.1M 的盐酸，即样品中 HCl 的终浓度为0.05M。若血清量很大，则最好按实验需要分装成小管，避免血清反复冻融，然后冻存于-80℃备用。若做 Elisa 实验，则取出所需要量的血清，待融化后再 1:1 加入等体积的 0.05M 的 HCl，既将血清稀释了 4 倍，HCl 的终浓度仍然为 0.05M，混匀后低速离心备用。

1. 取出整盒 ELISA kit（保存于 4℃冰箱）放在 37℃培养箱预热 0.5h 至常温，将摇床温度调至 31℃，转速为 150 转/min。

2. 用已灭菌的 MQ H2O，稀释 10XHRP wash buffer 至 1X。

3. 取出所需数量的 wells，放在 96 孔底板上，板上可用数字标记好行列，避免出错，准备纸巾，铺 8 层左右，比底板略大即可。1X HRP wash buffer 300ul/well，沿着孔壁缓慢加入，以免破坏杯底的抗体。加完后用手轻微震荡 5s，迅速翻转，将液体甩入水池，再在纸巾上拍打，不能太轻，也不能太用力，杯底朝上，尽量将杯内所有液体倒干净，如上重复洗 3 遍，保证每孔湿润。此后每次加入液体均沿着杯壁缓慢加入，移液枪枪头不可接触杯内液体。加入不同样品时要及时更换移液枪枪头，加入相同液体时，可从不同方向沿杯壁加入，避免污染原管液体。

- 1 - 酶联免疫吸附试验 elisa原理

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的实验室技术，用于检测生物分子如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。ELISA技术基于抗原和抗体的特异性结合，通过酶标记物和底物的反应来检测分子的存在或浓度。

ELISA技术的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等几种。其中，间接ELISA是最常见的类型，下面将详细介绍其原理和步骤。

一、间接ELISA的原理

间接ELISA利用抗体与抗原的特异性结合来检测分子的存在或浓度。该方法需要用到两种抗体：第一种是特异性抗体，用于检测目标分子；第二种是酶标记抗体，用于检测第一种抗体的结合情况。

具体步骤如下：

1. 将抗原溶液加入微孔板中，并在室温下孵育一定时间，使抗原吸附于微孔板表面。

2. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗原和杂质。

3. 加入一定浓度的非特异性蛋白质，如牛血清蛋白或奶粉，以防止非特异性结合。

4. 加入一定浓度的特异性抗体，使其与抗原结合。

5. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗体和杂质。

6. 加入一定浓度的酶标记抗体，使其与第一种抗体结合。

7. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的酶标记抗体和杂质。 - 2 - 8. 加入底物，使酶标记抗体产生颜色反应。

9. 测量吸光度，来确定目标分子的存在或浓度。

二、间接ELISA的优缺点

间接ELISA具有以下优点：

1. 可以检测极低浓度的分子，如病毒和荷尔蒙。

2. 可以同时检测多个样本。

3. 可以检测多种类型的生物分子，如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。

4. 可以使用多种酶标记抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和过氧化物酶（POD）等。

ELISA原理及步骤

ELISA，即酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent

assay），是一种常见的免疫学实验技术，在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。它基于抗原与抗体的特异性结合，在酶的催化下，通过颜色的变化来检测和定量分析目标分子的存在。

一、ELISA原理

1.包被：将抗原或抗体固定在微孔板表面。

2.孵育：加入待测标本，使抗原和抗体充分结合。

3.清洗：去除未结合的物质。

4.检测：加入酶标记的抗体或底物，与已结合的抗原或抗体反应。

5.测定：加入底物后，产生可测量的信号，如颜色变化。

6.分析：对信号进行测量和定量分析。

二、ELISA步骤

1.准备试剂和材料：

-抗原或抗体：根据需要选择合适的抗原或抗体。

-微孔板：常用的是96孔或384孔微孔板。

-缓冲液：包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。

-酶标记二抗和底物：根据需要选择适合的酶标记二抗和底物。

2.包被抗原或抗体： -将抗原或抗体稀释至合适的浓度。

-加入微孔板孔中，使其吸附在孔底。

-孵育在4℃或37℃下，一般需要数小时或过夜孵育。

3.添加标本和控制样品：

-将待测标本和控制样品逐孔加入微孔板中。

-孵育一段时间，使抗原和抗体发生特异性结合。

4.洗涤：

-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。

-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。

5.加入酶标记二抗：

-将酶标记的二抗加入每个孔中。

-孵育一段时间，使其与已结合的抗原或抗体结合。

6.洗涤：

-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。

-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。

7.加入底物：

-加入适合的底物。

-孵育一段时间，使底物与酶发生反应。

8.反应停止： -加入适当的溶液，停止底物酶反应。

9.测定信号：

-使用光密度测定仪读取每个孔的吸光度。

-记录吸光度值，用于后续数据分析和定量结果。

三、ELISA的注意事项

-实验过程中需严格控制温度和时间，尤其是孵育和洗涤步骤。

ELISA的概念、原理、操作步骤

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorentAay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(一) 原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、��9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二) 操作步骤

方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1. 包被：用0.05MH9.�短妓嵫伟�被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ "、“-"号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。