血液样本核酸提取注意事项
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sh@ 血液基因组提取注意事项(DP319)
样本保存及预处理:
1. 血液样本通常保存在-20℃或-80℃低温保存,如果放置4℃建议不超过一个星期。
哺乳动物的
红细胞里是没有细胞核的,所以首先要把红细胞裂解掉,然后再裂解白细胞提取基因组DNA ,一般采用100ul 以上的血液进行提取。
2. 血液的抗凝剂的选择:如果是用来做分子生物学实验的血液最好采用EDTA 、枸橼酸钠(也
叫柠檬酸钠),尽量不要采用肝素。
3. 冷冻的血液取出后37度速溶能有效避免DNA 在血液融化过程中的降解。
DNA 提取过程
1. 细胞裂解时要注意样本量和裂解溶液的量想匹配,确保样本充分裂解。
如需两次CL 裂解,则
最好第一次加入的CL 的量多一些。
例如600ul 血液一共加入1.5ml 的裂解液CL ,分两次建议第一次800ul 裂解液CL ,第二次700ul 裂解液CL 。
2. 加入裂解液CL 后要保证充分混匀。
离心后沉淀应为淡粉色或白色沉淀。
如果沉淀颜色较红,
则需再加入裂解液CL 进行裂解。
3. FG 和蛋白酶K 的混合液最好现用现配,样本加入该混合液后立即涡旋至无团块。
4. 水浴时期间适当混匀样本,以助于裂解。
5. DNA 使用异丙醇进行沉淀,常温的异丙醇即可,但冰冷的异丙醇更有助于DNA 的沉淀。
6. 溶液法的洗涤方式是使用70%的乙醇对沉淀洗涤,这里要注意加入乙醇后不是简单晃晃就行,
要让那个DNA 沉淀片漂浮在70%乙醇中,然后轻柔颠倒,这样才能充分对DNA 沉淀进行洗涤。
洗涤后离心去除乙醇,然后晾干 DNA ,这里所说的晾干是指将乙醇挥发干净,而不是将水也弄干。
如果核酸太干燥会很难溶解。
7. 紫外分光光度法是大家都熟悉的,如果我们使用的nanodrop 这种微量测定的就最简单了,加
入1、2ul DNA 原液就可以测值了。
但现在很多实验室还是用传统的仪器,需要50-100ul 的溶液才可以测定,这样就需要将DNA 进行稀释然后测定。
通常将离心柱法的稀释4-5倍,溶液法得到的DNA 稀释40-50倍。
具体稀释多少倍要根据实验得到的DNA 而定,即稀释后的DNA 测OD260的值在0.1-1之间。
纯度的公式为OD(260-320)/OD(280-320),这里列出的是260-320比上280-320,其中OD320是溶液背景值,这样计算的比值更准确的衡量DNA 的纯度。
浓度的计算是OD260的值乘以50ng/ul ,得率的话就再乘以稀释倍数。
8. 电泳检测核酸大家就更熟悉了,取2-5ul DNA 在0.7-1%的琼脂糖胶上电泳,观察电泳条带。
高
质量的DNA 的电泳条带应该是清晰锐利的。
如果出现拖尾现象,会考虑是基因组部分降解;如果加样孔里有很明亮的带,通常是蛋白污染。
通过这两种方法我们就可以判断得到的DNA 的质量是否满足我们下游的实验。