产纤溶活性酶凝结芽孢杆菌的分离鉴定及其酶活性质初探

题目产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离、鉴定与育种摘要首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行微波诱变，筛选出产量高、性状优良的正突变菌株，并用正交实验的方法，从发酵培养基三个主要成分（玉米粉、黄豆饼粉、酵母粉）对产酶条件进行优化，实验最后利用多相分类的方法对筛选出的正突变菌株做了菌种鉴定，初步确定为短芽孢杆菌。

引言淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途[1]。

现在淀粉酶主要来源于植物和微生物[2]并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事[3]。

本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，通过诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。

一、研究方法1、实验材料：河北大学生命科学学院院前的土壤2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、德汉氏小管、直尺、记号笔等。

诱变箱：微波炉（E30E-3）离心机、721分光光度计：3、培养基和试剂（1）培养基：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、种子培养基[4、7]、出发培养基[4、7]、糖发酵培养基、明胶培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基、蛋白胨液体培养基（吲哚实验）、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、M．R实验）、硝酸盐液体培养基、酪素培养基（2）试剂：碘液、孔雀绿染液、番红染液、乙醚、吲哚试剂、KOH、α-耐酚、甲基红、格里斯氏试剂、锌粉、3%H2O2 、柠檬酸缓冲液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水杨酸（注：所用药品均为分析纯）。

4、实验方法（1）细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-4、10-5、10-6分别涂布到淀粉培养基上，37℃倒置、过夜培养，影印，将碘液加到淀粉平板上，记录出现水解圈的单菌落的H/C值[5]。

产纤维素酶芽孢杆菌的鉴定与酶活力比较江学斌;成雪鸿;马苗鹏;邓仲晴;李嘉慧【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2022(49)4【摘要】【目的】从14株细菌中筛选产纤维素酶菌株,为新型饲料添加剂的开发提供材料基础。

【方法】采用刚果红染色法从14株细菌中初步筛选出产纤维素酶菌株;对产纤维素酶菌株进行菌落形态观察和16S rDNA基因序列同源性分析鉴定;使用刚果红染色法比较各菌株降解纤维素的能力,用DNS法检测各菌株的纤维素酶活力。

【结果】初步筛选出7株产纤维素酶菌株,经16S rDNA鉴定,其中4株为地衣芽孢杆菌、3株为枯草芽孢杆菌。

刚果红染色法初步判定7株芽孢杆菌纤维素降解能力大小表现为LW006>LW005>LW004>LW002>LW007>LW003>LW001,其中菌株LW006(枯草芽孢杆菌)降解纤维素能力最强,其透明圈直径达22.5 mm;经DNS法测定,7株芽孢杆菌的纤维素酶活力大小表现为LW006>LW005>LW004>LW007>LW003>LW002>LW001,其中菌株LW006纤维素酶活力最高,酶活力为1.22(±0.07)U/mL。

【结论】菌株LW006是相对高产纤维素酶的菌株,有望为新型饲料添加剂提供新的菌种资源。

【总页数】7页(P116-122)【作者】江学斌;成雪鸿;马苗鹏;邓仲晴;李嘉慧【作者单位】广州大学生命科学学院;华南农业大学生命科学学院/广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S816.7【相关文献】1.产纤维素酶芽孢杆菌DS1309的分离鉴定及产酶条件研究2.产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离鉴定及酶学性质研究3.一株源于红树林根际土壤产纤维素酶芽孢杆菌的鉴定及其酶学性质分析4.一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其酶促反应适宜条件初步研究5.以滤纸酶活力为指标优化解淀粉芽孢杆菌Tu-115菌株产纤维素酶液体发酵条件因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

上海农业学报2001,17(3):92～96　Acta Agriculturae Shanghai 文章编号:1000-3924(2001)03-92-05产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定顾真荣　马承铸(上海市农业科学院植物保护研究所,上海201106)韩长安(上海市农业技术推广服务中心,上海201103) 摘　要　从103份采自中国各地的土样中分离得到了312株芽孢杆菌,用平板透圈法筛选到3株产几丁质酶菌株G 1、G 2和G3。

经鉴定,G1为短芽孢杆菌(Bacillus brevis );G2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis );G3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )。

它们在几丁质平板上的透明圈直径以G1>G 3>G2为序,在以Schales '法测定壳聚糖酶活力时,其摇瓶发酵上清液的酶活力以G 3>G1>G2为序。

本文首次报道短芽孢杆菌产生几丁质酶和壳聚糖酶。

关键词　芽孢杆菌;几丁质酶;筛选;鉴定;测定中图分类号:Q 55;Q 939.124 文献标识码:A 几丁质又称甲壳素,是广泛分布于自然界的生物多聚物,每年都有上百亿吨的生物量产生,数量仅次于纤维素。

几丁质和几丁质酶的利用一直是生命科学中的重大课题,在环境保护、医学、化学和农业等方面具有重大的潜在应用价值[1,2]。

几丁质酶广泛存在于植物、动物和微生物中。

细菌的几丁质酶由于潜在的商业用途倍受人们关注,粘质沙雷氏菌(Serratia marc enscens )是人们长期来研究的热点[3]。

对环境和卫生方面安全的芽孢杆菌亦有较多的研究。

已报道能产几丁质酶的芽孢杆菌有环状芽孢杆菌(B .circulans )[4,5]、蜡状芽孢杆菌(B .cereus )[4]、地衣芽孢杆菌(B .licheniformis )[4]和枯草芽孢杆菌(B .subtilis )[4,6]。

产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法注明：蓝色字体是已修改的一、实验目的1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法；2、掌握测定酶活力的方法；3、培养自行设计、实施实验的能力。

二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。

待实验前取样即可。

2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。

在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。

3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。

4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。

三、实验材料1、土壤样品湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。

2、培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml3、试剂草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液4、玻璃器皿锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL）10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备：天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种环等四、实验步骤1、样本采集①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。

产纤溶活性酶芽孢杆菌的分离鉴定及活性测定班级：一班组长：高梅组员：周彩华 周春香 黄金惠 黄媛 高艳君 王悦琴 朱汉墨 李春林 高梅实验目的：1、掌握培养基的配制方法2、学习从豆豉中分离产纤溶酶芽孢杆菌3、学习、掌握微生物的鉴定方法4、学习、掌握纤溶酶活性的测定方法实验原理：1、纤溶酶能降解纤维蛋白和纤维蛋白原，水解多种凝血因子(Ⅱ.Ⅴ.Ⅶ.Ⅷ.Ⅹ.Ⅺ)实验材料：1、分离材料：豆豉 、培养皿2、主要试剂：尿激酶 、猪纤维蛋白原 、凝血酶、424)(SO NH 冰乙酸 、无水乙醇 、EDTA 、NaCL 、葡萄糖 、蛋白胨 、琼脂 、酵母膏 等3、培养基制备：① 菌株分离培养基（LB 培养基）：蛋白胨 1 %，酵母粉0.5 %，氯化钠1 %， 琼脂1.5 %，p H7.0 ，121℃ 灭菌20min 。

② 种子液培养基：蛋白胨1 %，酵母粉0.5 %，氯化纳1 %，p H7.0 ，121℃ 灭菌20min 。

③ 发酵培养基：NaCl 2 %，葡萄糖 2 %，p H7.0 ，115℃灭菌20min(其中 NaCl 和葡萄糖溶液要单独灭菌，灭菌后再混合，以免葡萄糖在高温时炭化失去作用) 。

④ 营养琼脂斜面培养基：牛肉膏0.3 %，蛋白胨1 %，NaCl 0.5 %，琼脂2 %，p H7.2～7.4 ，121℃ 灭菌20min 。

4、缓冲液的配制：硼酸缓冲液 0.05mol/ L 、 p H7.8，巴比妥钠缓冲液0.04mol/ L 、 p H7.8 ; Tris-HCl 缓冲液0.05mol/ L 、 p H7.4试验方法步骤：1、样品采集：市场选购一定数量的豆豉2、菌株的筛选：① 菌株的初筛：称取分离材料（豆豉）约0.5g ，放入盛有玻璃珠的100mL 无菌生理盐水三角烧瓶中稀释后,充分振荡摇匀,选择适宜的3个稀释度涂布于LB 平板上,37℃倒置培养24h 。

挑取拉粘丝的单菌落,经平板划线纯化得到单菌落转接于营养琼脂斜面37℃恒温培养18h～24h后,放入4℃冰箱保存备用。

产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定吴月婷摘要：从土壤中分离得到一株产淀粉酶的芽孢杆菌X-1，对其进行形态学鉴定和生理生化特性分析，包括菌落形态、菌体形态、糖利用情况、生长pH范围、耐盐范围、明胶液化和酪素的水解等，初步鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或地衣芽孢杆菌（Bacillus lentus）。

关键词：产淀粉酶；芽孢杆菌；分离；初步鉴定淀粉酶(Amylase)是指能分解淀粉糖苷键的一类酶，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶等，在生物体的糖类代谢中起重要的作用。

其中α-淀粉酶（1,4-α-D-glucan glucanohydrolase）能水解淀粉大分子的α-1,4-糖苷键，生成糊精、麦芽寡糖、麦芽糖、葡萄糖等水解产物[1]。

α-淀粉酶在植物、动物和微生物中都广泛存在，常见的产淀粉酶微生物有芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉、米曲霉、红曲霉和根霉等[2-7]。

芽孢杆菌属(Bacillus)是一类能产生芽孢的革兰氏阳性细菌，具有较强的抵抗不良环境的能力，如耐酸碱、耐高温的能力较强。

芽孢杆菌中较多菌种具有高淀粉酶、蛋白酶活性，近年来被广泛地用于动物饲料业，特别是作为水产饲料的添加剂。

例如在银鲫饲料中添加了0.1%的芽孢杆菌后，银鲫肠道和肝胰脏的淀粉酶活性提高了3.7%和129.5%[8]，能够有效帮助动物对饲料的消化吸收，同时作为一种良好的免疫激活剂，能增强动物的免疫力和抗病力[9]。

此外，利用芽孢杆菌产生α-淀粉酶，在食品生产中也有广泛应用。

笔者从土壤中分离得到产淀粉酶的芽孢杆菌，进行种属的初步鉴定，以期为芽孢杆菌在动物饲料业和食品生产中的发开应用提供理论依据。

1 材料与方法1.1 材料土壤材料采集于浙江师范大学取杏园食堂草坪土壤表层5~10厘米下的肥土。

1.2 培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨l%、葡萄糖0.5%、Nacl 0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉0.8%。

地衣芽胞杆菌产纤溶酶的分离、纯化及其酶学性质研究苏雪燕;车程川;刘金峰;杨革【摘要】以地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WBL-3进行固体发酵生产纤溶酶.通过生理盐水浸提、离心去除菌体、硫酸铵分级盐析、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析对酶进行分离纯化,SDS-PAGE电泳检测酶的分子量大小,并对该纤溶酶的酶学性质进行研究.结果表明:经凝胶过滤层析后,纯化倍数为33.19,回收率12.39％；SDS-PAGE电泳检测为单一蛋白条带；酶学性质分析表明:酶的最适反应温度为55℃,稳定性随着温度的升高而降低；最适反应pH为8.5,pH7-10范围内酶活稳定性较高；Mg2+对该酶有微弱的激活作用,Cu2+、Ag+、Fe3+、Hg2+、Pb2+对酶有较强的抑制作用.本研究为开发新的溶栓药物提供了新的选择.【期刊名称】《曲阜师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(039)003【总页数】5页(P85-88,94)【关键词】纤溶酶;分离纯化;酶学性质【作者】苏雪燕;车程川;刘金峰;杨革【作者单位】曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市;曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市;曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市;曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市【正文语种】中文【中图分类】Q939.99血栓性疾病包括血栓形成和血栓栓塞两种病理过程所引起的疾病，其发病率已高居各疾病之首，并且随着人民生活水平的提高和生活方式的改变，近年来有逐渐增加之势，严重威胁人类健康，造成了极其严重的损失．因此，开发治疗血栓性疾病的药物成为当前国内外医学研究的重点和热点[1-2]．1987年，日本学者须见洋行博士从日本传统发酵食物—纳豆中分离得到一种具有溶解血栓功能的活性物质，并将其命名为纳豆激酶(Nattokinase，以下纳豆激酶简称NK)[3]．NK不但具有明显的溶栓活性，而且能够激活体内的纤溶酶原，增加内源性纤溶酶的含量，还具有抗血栓、降血压、抗菌、抗氧化、预防癌症等多种生理功能；与传统溶栓药物相比，NK具有可口服、安全无毒、无抗原性、半衰期长且不易引发出血等优点，因而开发前景广阔，可能成为新一代的抗栓溶栓药物[4-6]．本研究以实验室保藏的纤溶酶高产菌株Bacillus licheniformis WBL-3进行发酵，并对发酵条件进行优化，在最佳发酵条件下产酶量可达2725 U/g纳豆(湿重)，是目前文献报道中酶活力最高的，且具有较好的溶栓效果．在此基础上，对该纤溶酶进行分离纯化，并对其进行酶学性质的研究，为今后开发新的溶栓药物及产品的工业化生产打下坚实的基础．1.1 原料与试剂纤维蛋白原(Fibinogen)、尿激酶(Urokinase，活力2000 IU/支) 、凝血酶(Thrombin，活力690 IU/支)、低分子量标准蛋白、考马斯亮蓝G-250、葡聚糖凝胶Sephadex G-75、SP Sepharose Fast Flow购于济南力戈生物有限公司，其他试剂均为国产分析纯．发酵培养基：花生20 g，蔗糖0.4 g，NaCl 0.2 g，初始含水量35%，121 ℃蒸煮30 min．1.2 菌种地衣芽孢杆菌WBL-3(Bacillus licheniformis WBL-3)为本实验室保藏菌种．2.1 蛋白质含量及纤溶酶酶活检测蛋白质含量采用Bradford法进行测定[7]，牛血清白蛋白为标准蛋白．酶的纤溶活性的测定采用日本学者修改的纤维蛋白降解法[8]：适当稀释的粗酶液与缓冲液混合，加入纤维蛋白原溶液与凝血酶，37 ℃水浴10 min后加入三氯乙酸溶液终止酶反应，反应混合液12，000 rpm/min离心5 min，取上清与Na2CO3溶液和福林试剂混合，37 ℃水浴30 min后，测量660 nm处的吸光值．纤溶酶活性单位定义为：每分钟产生1 g酪氨酸所需的酶量．2.2 固体发酵及粗酶液的制备地衣芽胞杆菌WBL-3经活化、种子培养后接种到固体发酵培养基中，37 ℃发酵24 h，4 ℃后熟12 h．用生理盐水浸提，离心去除菌体后取上清液，即为纤溶酶粗酶液[11]．2.3 纤溶酶的分离纯化依次采用硫酸铵分级盐析[10]、离子交换柱层析[11-13]、葡聚糖凝胶过滤层析[14-15]对纤溶酶进行分离纯化．2.4 SDS-PAGE电泳检测12%分离胶和5%浓缩胶，考马斯亮蓝染色法显色蛋白条带，与低分子量标准蛋白质分子量进行比较，测定酶的分子量及纯度[16]．2.5 纤溶酶酶学性质研究分别研究不同温度和pH对纤溶酶酶活及稳定性的影响，以及金属离子对酶活的影响[17-20]．3.1 硫酸铵盐析曲线图1显示，随硫酸铵饱和度的增加，上清液中酶活力逐渐降低，沉淀酶活力逐渐增加．在硫酸铵饱和度达到25%之前，沉淀中酶活力很低，而在饱和度大于60%之后，沉淀中酶活力基本保持稳定，继续提高硫酸铵饱和度，酶活也不再增加；因而首先加硫酸铵至25%饱和度去除杂蛋白，然后继续加硫酸铵至60%饱和度沉淀目的纤溶酶．3.2 层析谱图及纯化结果由图3可知，离子交换柱层析图谱中出现5个吸收峰，将其分别收集并测定酶活及蛋白质含量，第三个吸收峰有明显的纤溶活性，其余4个吸收峰均检测不到酶活，因此，吸收峰3为纤溶酶的吸收峰；由表1可知，经离子交换柱层析后，纯化倍数为12.82，NK回收率为38.29%．由图4可知，凝胶过滤层析中共出现2个吸收峰，分别测定酶活力和蛋白质含量，第一个吸收峰检测不到纤溶活性，第二个峰酶活性较高，因此，第二个吸收峰即为酶的吸收峰；由表1可知凝胶过滤层析的纯化倍数为33.19，回收率为12.39%．3.3 SDS-PAGE电泳检测粗酶液经硫酸铵分级盐析、透析、离子交换柱层析和凝胶过滤层析后的产物进行SDS-PAGE电泳检测，如图4所示．图4显示，经分离纯化后得到单一的NK蛋白条带，说明分离得到的酶已经达到电泳纯，分子量约为27 KD，与文献报道的纳豆激酶分子量一致[26]．3.4 酶的最适温度及温度稳定性图5显示，随着温度的升高，酶的相对活性逐渐升高，55 ℃时，酶活达到最大值，温度继续升高，可能因变性而导致酶活性迅速降低，因此，该纤溶酶的最适反应温度为55 ℃．图6显示，在-20 ℃下保存7 d，酶活力基本不变；4 ℃条件下保存，酶活逐渐丧失，保存7 d后，仅剩余52%；37 ℃条件下保存，酶活丧失更快，保存1天后，酶活仅剩余58%，保存2 d和3 d后，酶活只有原来的32%和15%，第四天酶活力全部丧失，基本检测不到，表明酶适合保存在-20 ℃条件下．3.5 酶的最适pH及pH稳定性由图7显示，随着pH逐渐升高，酶的相对酶活先升高后降低，pH=8.5时，酶活达到最大值，因此该纤溶酶的最适反应pH为8.5．由图8显示，在pH7-10的范围内，酶活力相对稳定，均在90%以上，pH低于7时，酶活迅速降低，而pH大于10后，酶活虽然降低，但较为缓慢，说明酶在碱性条件下保存较为稳定．3.6 金属离子对酶活性的影响表1显示，Mg2+对纤溶酶活性有微弱的激活作用，K+、Ca2+、Na+对纤溶活性影响不大，其他金属离子如Zn2+、Al3+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Fe3+、Fe2+、Ag+、Hg2+、Pb2+对酶活有不同程度的抑制作用，且Cu2+和Hg2+抑制作用最为明显．本研究以花生为主要发酵底物，在发酵条件优化的基础上，对发酵产生的纤溶酶进行分离纯化，浸提后离心去除菌体，硫酸铵分级盐析以及离子交换柱层析和凝胶过滤层析之后，得到电泳纯的纤溶酶，比活力为211059.38 IU/mL，纯化倍数33.19，回收率12.39%．本研究对纯化酶的酶学性质进行研究发现，最适反应温度为55 ℃，低温保存有利于保持酶活，最适反应pH为8.5，pH7-10范围内酶活性对稳定，说明在碱性条件下酶较活性稳定，金属离子对酶没有明显的激活作用，大部分金属离子对酶有不同程度的抑制作用，Cu2+和Hg2+抑制作用最为明显；该纤溶酶具有良好的抗凝和溶栓作用，能有效预防血栓的形成．本研究为研发新型溶栓制剂及以后的工业化生产提供了理论依据．【相关文献】[1]Wang S L，Wu Y Y，Liang T W. 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