实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH25分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。

样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为：35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS电泳缓冲液浓度成分0.4M MOPS，pH 7.00.1M乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 µl溶液。

胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

②准备RNA样品取3µgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。

加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

③电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。

5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。

还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。

在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

用数码照相机拍下电泳结果。

3样品cDNA合成①反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2μl2上游引物0.2μl3下游引物0.2μl4dNTP0.1μl5逆转录酶MMLV0.5μl6DEPC水5μl7RNA模版2μl8总体积10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。

③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl 按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。

②反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10μl2阳性模板上游引物F0.5μl3阳性模板下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6阳性模板DNA5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10μl2内参照上游引物F0.5μl3内参照下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6待测样品cDNA5μlO32.5μl7ddH28总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

反应体系：序号反应物剂量110× PCR缓冲液 2.5 ul溶液 1.5 ul2MgCl23上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5dNTP混合液 3 ul6Taq聚合酶 1 ul7cDNA 1 ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72ºC延伸5分钟。

②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR 产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

6 待测样品的待测基因实时定量PCR①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

体系配置如下：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10 ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP 1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。

反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

7 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。

PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA 丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。

所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。

反转录反应反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。

反转录反应条件如下。

37°C 15 min（反转录反应）85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）Real Time PCR反应选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。

每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。

2）三步法PCR首先95°C 作用3 min。

PCR进行35个循环。

步骤温度时间变性95°C 30 秒退火58°C 30 秒延伸72°C 30 秒融解曲线温度时间变温速度95°C 0秒20°C/秒55°C 15秒20°C/秒95°C 0秒0.1°C/秒PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1将PCR反应的试管与反应板紧贴。

2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍3微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。

4不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。

5对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。

没有扩增产物：1在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。

2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。

3检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。

4检查模板和引物的用量。

5增加循环次数和/或模板DNA的用量。

泳道中出现模糊条带：1减少循环次数或模板DNA的用量。

2提高退火温度，但不要超过68℃。

3重新设计引物或设计更长的引物。

其他值得注意的条件：1建议使用0.2-ml薄壁管。

厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

2最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。

3大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。

4建议使用 1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或 2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP组合的混合物。

然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。

5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。