dna提取实验报告

实验六 质粒DNA的提取

一、实验目的

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒

二、实验原理

质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS（十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

三、实验材料与试剂

1、实验材料 大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）

2、实验试剂

(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；

(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；

(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；

(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；

(5) 异丙醇、70%乙醇；

四、实验步骤

（一）提取质粒

1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成）

2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。

3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm离心1min。

4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。 6. 加200μl新配制的溶液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,注意动作一定要轻柔缓和，切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。

质粒DNA的提取与鉴定

实验日期 2020年5月14日 室温 25°C 成绩

一、实验报告摘要

【实验题目】

质粒DNA的提取与琼脂凝胶电泳鉴定

【实验目的】

1、掌握质粒提取原理和各种试剂的作用。

2、掌握琼脂糖凝胶电泳原理和操作。

二、实验原理

1、质粒：

质粒是独立存在于染色体外，能自主复制并能稳定遗传的一种环装双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。细菌质粒是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA

2、琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一，该技术操作简便，快速。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA。此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

三、操作要点： （1）质粒DNA的提取

1、收取细菌：将4mL细菌培养液分为2次加入2mL的塑料离心管(子弹头)内，每次以12000r/min离心1min(注意平衡)弃去上清液。

2、加入100uL用冰预冷的溶液I，用移液枪将细菌沉淀打散成为悬浮液。(溶液 I放置冰中)

3、加入200uL溶液II，盖紧盖口，翻转离心管5次，充分混合内容物，避免振荡，将离心管置于冰上。

4、加入150uL用冰预冷的溶液III，盖紧盖口，翻转离心管，温和摇匀直至粘稠状的细菌裂解物出现，置于冰上5分钟。(溶液放置冰中)

5、用微量离心机12000r/min离心5分钟。取上清液移到另一离心管。

6、加入等量的酚:氯仿(1:1)混合液，轻轻混匀，12000r/min离心7分钟，将上清液收集到新的离心管中。

7、加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻混匀，1200 0r/min离心5分钟，弃去上清液，倒置在滤纸上干燥，漓尽液体。

一、脱腐

1. 10ml离心管中加入0.5g沉积物（干重）和5ml脱腐缓冲液[100mmol/L

Tris-HCl,PH10.0,50mmol/L Na2EDTA,200mmol/L NaCl,100mmol/L Na4P2O7,1%(质量浓度)PVP,0.05%（质量浓度） TritonX-100]，漩涡混合3min，60℃水浴5min，3000×g离心3min。根据上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。（土壤与沉积环境样品腐殖酸脱除新方略，席峰）

2. 10ml离心管中加入0.5g沉积物（干重）和5ml PBS buffer(8g NaCl，0．2g KC1，1．44g Na2HPO4，0．24g KH2PO4，溶于1L水中，pH=7．4) 旋涡混合3min, 60℃水浴5min, 3000×g离心3min。根据上清颜色再重复洗涤与离心1-2次，至上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。（从颗粒污泥中提取DNA的几种不同方法比较，陈竹）

二、 裂解与提取

1. 冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS法（可用于微生物群落分子生态学研究的活性污泥总DNA 提取方法研究，高平平）

1) 置0.5g沉积物（干重）于10ml 的灭菌离心管中离心5m in( 8000×g, 4℃) , 弃上清, 沉淀(约100mg) 悬浮于5ml无菌水中。向管内加入0.35g灭菌玻璃珠(直径2～3mm) , 将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打15min, 离心8min (8000×g, 4℃),弃上清,沉淀用于细胞裂解。

2） 向沉淀中加入0.5ml灭菌的TENP缓冲液(50mmol/L Tris-base,20mmol/L EDTA ,

100mmol/L NaCl, 0.01g/ml 聚乙烯吡咯烷酮, pH10) , 悬浮后将菌液在液氮中冷冻3min, 沸水煮2min, 重复3次后进行菌体离心(10min, 12000×g, 4℃)。上清液快速置于冰上留用, 沉淀用于进一步裂解。

四川大学实验报告

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题目：质粒DNA的提取及检测

一． 实验目的:

1. 学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；

2. 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

二． 实验原理

1. 质粒 (Plasmid)：

一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。

2.载体(Vector)：

要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。

3.分离质粒DNA：

（1）培养细菌使质粒扩增；

（2）收集和碱裂解细菌；

（3）分离和纯化质粒DNA。

4.碱裂解法

（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0)

作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解

（2）溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制

作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性 四川大学实验报告

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（3）溶液 Ⅲ ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml

作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。

5.电泳

带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。