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微⽣物学实验技术（研究⽣）⾷品微⽣物实验技术讲义（硕⼠研究⽣⽤）⾷品科学与⼯程学院微⽣物学实验技术的体系具有独特性：需要独特的实验室装备和独⽴的训练技术包括：显微镜术和制⽚染⾊技术、⽆菌操作技术、消毒灭菌技术、纯种分离培养技术、合成培养基技术、选择性和鉴别性培养基技术、深层液体培养技术、厌氧培养技术、菌种保藏、复壮技术、菌种选育技术等。
第⼀章微⽣物的纯培养和显微技术计划学时：2重点：微⽣物的分离和纯培养技术，常⽤的菌种保藏⽅法。
细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。
⼤多数动物植物的研究、利⽤都能以个体为单位进⾏，⽽微⽣物由于个体微⼩，在绝⼤多数情况下都是利⽤群体来研究其属性，微⽣物的物种（菌株）⼀般也是以群体的形式进⾏繁衍、保存。
在微⽣物学中，在⼈为规定的条件下培养、繁殖得到的微⽣物群体称为培养物（culture），⽽只有⼀种微⽣物的培养物称为纯培养物（pure culture）。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利⽤和重复结果，因此把特定的微⽣物从⾃然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进⾏微⽣物学研究的基础。
相应的，微⽣物个体微⼩的特点也决定了显微技术是进⾏微⽣物研究的另⼀项重要技术，因为绝⼤多数微⽣物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进⾏观察和研究。
显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等⽅⾯的内容。
实际上，正是由于显微技术及微⽣物纯培养技术的建⽴才使我们得以认识丰富多彩的微⽣物世界，并真正使对微⽣物的研究发展成为⼀门科学。
第⼀节微⽣物的分离和纯培养⼀、⽆菌技术微⽣物通常是⾁眼看不到的微⼩⽣物，⽽且⽆处不在。
因此，在微⽣物的研究及应⽤中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微⽣物群中分离出特定的微⽣物，⽽且还必须随时注意保持微⽣物纯培养物的“纯洁”，防⽌其他微⽣物的混⼊。
在分离、转接及培养纯培养物时防⽌其被其他微⽣物污染的技术被称为⽆菌技术（aseptic technique），它是保证微⽣物学研究正常进⾏的关键。
现代微生物学实验技术课程论文实验一、耐高盐菌的分离与纯化1、实验目的1、认识并了解土壤微生物物种的多样性；2、分离纯化土壤环境中耐盐的菌株。
2、实验方法2.1 实验器材与试剂恒温振荡培养箱；显微镜；超净台；灭菌锅；锥形瓶；培养皿；结晶紫染色液；液体培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L；固体培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂条20g/L；2.2 实验步骤2.2.1土壤的制备：选择高盐的土壤区域，去表层土，挖5-20cm深度的土壤数10g，装入已灭菌的牛皮纸袋。
2.2.2培养基的配制与灭菌：液体培养基200ml，分装为4瓶，每瓶50ml，固体培养基100ml。
灭菌：121°C，20min，高压蒸汽灭菌。
灭完菌后取出，两瓶50ml的液体培养基中各加入15%的NaCl，另外两瓶50ml的液体培养基中各加入5%的NaCl，混匀。
同时将固体培养基取出倒平板。
2.2.3耐盐微生物的富集：分别在NaCl浓度为5%，15%的50mL 液体培养基中加入相同量5g的土壤，28℃、150r/min摇床培养。
培养富集4天后，从富集一代的培养液中吸取5%的菌液到新的NaCl浓度为5%，15%的液体培养基中继续富集培养3天。
2.2.4耐盐微生物的分离纯化：取NaCl浓度为5%，15%富集培养的培养物镜检（结晶紫染色），发现NaCl为5%的浓度下的菌更密集，挑取该浓度的菌液，进行划线分离，得到纯培养物后再挑取两种不同的菌落再次划线分离，从而得到单菌落。
3、实验结果通过对高盐土壤中微生物的富集及分离纯化，得到如下图两株菌株，命名为L-1、L-2。
菌株L-1产黄色色素，菌落呈黄色，圆形，表面光滑，边缘整齐，菌株L-2产橘红色色素，菌落呈橘红色，圆形，表面光滑，边缘不整齐。
实验二、耐盐菌的形态学及生理生化反应1、实验目的1、从形态学特点对耐盐菌株进行初步鉴定；2、对耐盐菌株进行生理生化实验，进一步鉴定菌株。
现代微生物学检验基本技术随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。
医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。
第一节微生物形态学检查细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，它是细菌分类和鉴定的基础，可根据其形态、结构和染色反应性等，为进一步鉴定提供参考依据。
一、显微镜检查由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。
一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。
常用显微镜有如下几种。
1．普通光学显微镜采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。
显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。
故用油（浸）镜放大1 000倍，能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。
普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。
2．暗视野显微镜常用于观察不染色微生物形态和运动。
在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。
3．相差显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。
在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。
4．荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。
目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。
滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。
用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。
微⽣物实验报告概要：微⽣物在⾃然界是分布最⼴、种类最多的⼀类⽣物物种；⽆论在万⽶的⾼空，还是在万⽶的深海，或是⾼原冻⼟，抑或是极地冰⼼，⽕⼭喷发地域、盐湖、热泉等都能寻找到它们的踪迹；可以这么说，微⽣物的⽣存环境涵盖了地球上的所有⽣物。
由于这些微⽣物个体微⼩、造型简单和⾁眼难以观察到，因此，⼈们往往忽略了它们的存在，⽽这些微⽣物⼜常是引起⼯⼚、医院和微⽣物学实验室中各种实验材料、实验菌种、产品和⼿术创⼝等污染的祸根。
所以研究微⽣物的多样性、识别菌种种类、掌握⽆菌操作技术具有相当⼤的现实意义。
本论⽂分为四个实验，它包括：环境微⽣物的采集与观察、细菌的形态特征观察与鉴定、放线菌与真菌的形态特征观察与鉴定、环境中噬菌体的分离与纯化。
我们通过对⼟壤和⽔库中的微⽣物的采集，获得⼀系列不同种类的微⽣物，然后对得到的微⽣物进⾏选择培养和纯化，分离出细菌、放线菌、真菌、噬菌体等，再对其进⾏进⼀步的观察和研究，从⽽了解各种微⽣物的基本形态特征、结构特点及⽣活环境对其⽣长的影响等。
同时通过⾃⼰动⼿，我们的实验操作技术得到强化，掌握了光学显微镜的基本操作、⽆菌操作技术及染⾊、培养、分离和计数等微⽣物实验的基本操作⽅法。
关键词多样性分离纯化形态特征⽆菌操作培养实验⽬的1.树⽴严格的⽆菌意识和掌握正确的⽆菌操作⽅法。
2.了解光学显微镜显微观察的基本操作和油镜头的使⽤⽅法及微⽣物的稀释涂布分离⽅法与技术3.学习观察细菌、放线菌以及霉菌的群体形态及培养特征；4.了解⾰兰⽒染⾊原理，掌握⾰兰⽒染⾊技术；5.熟悉细菌芽孢和荚膜的染⾊⽅法；6.初步学习平板菌落计数以及活菌检测的⽅法7.初步掌握平板菌落转接平板及固体斜⾯的菌种纯化⽅法8.掌握观察放线菌和丝状真菌以及酵母菌显微结构及菌落的基本⽅法9.掌握测定微⽣物细胞⼤⼩的测微技术和单细胞微⽣物进⾏显微直接计数的⽅法。
10.了解从环境污⽔中分离噬菌体的普通原理11.熟悉并掌握噬菌体的扩增、培养与检测的实验⽅法和噬菌斑效价的测定⽅法。
实验一、微生物学基础实验实验1. 鞭毛染色法及活菌活动性暗视野显微镜观察【目的要求】1．了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色的方法，并了解鞭毛的形态特征。
2．学习暗视野显微镜操作技术。
【实验器材】菌种：枯草芽孢杆菌1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，铜绿假单细胞菌1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
溶液和试剂：硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液。
仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，镊子等。
【基本原理】细菌的鞭毛极纤细，直径一般为0.1-0.2um，只有用电子显微镜才能观察到。
但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。
鞭毛染色的基本原理是：在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。
常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。
采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。
如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或压滴法直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。
此法较快速、简便。
压滴法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置于显微镜下观察。
暗视野显微镜又叫暗场显微镜，是一种通过观察样品受侧向光照射时所产生的散射光来分辨样品细节的特殊显微镜。
暗视野显微镜和一般的明视野显微镜区别在于二者的聚光器不同，暗视野显微镜装有一个中央遮暗的聚光器，使光线不能通过聚光器，而只能从聚光器四周边及未遮暗的部位斜射到载玻片的标本上。
因光线是斜射的，不能进入物镜，故观察的视野是暗的，而聚光器斜射到菌体上的光线，因光散射作用而使菌体发出亮光，反射到物镜内，这样在显微镜中可见到暗视野中明亮的物像。
暗视野显微镜主要用于检查未染色标本的形态和运动能力。
【操作步骤】1．鞭毛染色（硝酸银染色法）（1）载玻片制备：将载玻片用洗涤剂清洗干净，置于95%乙醇中浸泡5min，使用时用镊子取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
《微⽣物学》实验操作⼤全,考研必备⽬录实验⼀培养基的配制实验⼆消毒与灭菌实验三显微镜油浸系物镜的使⽤实验四细菌形态的观察实验五细菌的⾰兰⽒染⾊实验六放线菌的形态观察实验七酵母菌的形态观察实验⼋霉菌的形态观察实验九细菌数量的测定(设计性实验)实验⼗微⽣物的接种⽅法实验⼀培养基的配制⼀、实验⽬的和内容⽬的：学习和掌握配置培养基的⼀般⽅法和步骤内容：1、⽜⾁膏蛋⽩胨的配制2、⾼⽒1号培养基的配制3、马丁⽒培养基的配制⼆、实验材料和⽤具⽜⾁膏、蛋⽩胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/l NaOH、1mol/l HCl、KNO3、NaCl 、K2HPO4*3H2O、MgSO4*7H2O、 FeSO4*7H2O。
试管、三⾓瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、⽜⾓匙、pH试纸、棉花、⽜⽪纸、记号笔、线绳、纱布三、操作步骤（⼀）⽜⾁膏蛋⽩胨培养基的配制⽜⾁膏蛋⽩胨培养基是⼀种应⽤最⼴泛和最普遍的细菌基础培养基。
其配⽅如下：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl5g，琼脂15~20g，⽔1000ml，pH7.4~7.61、称药品按实际⽤量计算后，按配⽅称取各种药品放⼊⼤烧杯中。
⽜⾁膏可放在⼩烧杯或表⾯⽫中称量，⽤热⽔溶解后倒⼊⼤烧杯，⽜⾁膏极易吸潮，故称量时要迅速。
2、加热溶解在烧杯中加⼊少于所需要的⽔量，然后放在⽯棉⽹上，⼩⽕加热，并⽤玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充⽔分⾄所需量。
若配制固体培养基，则将称好的琼脂放⼊已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补⾜所失⽔分。
3、调pH 检测培养基的pH，若偏酸，可滴加1mol/l NaOH，边加边搅拌，并随时⽤pH试纸检测，直⾄达到所需pH范围。
若偏碱，则⽤1mol/l HCl进⾏调节。
PH的调节通常放在加琼脂之前。
应注意pH值不可调过头，以免调回影响培养基内各离⼦的浓度4、过滤液体培养基可⽤滤纸过滤，固体培养基可⽤4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。
微⽣物实验（⽣物实验三）⽣物⼤实验三《微⽣物学》部分实验⽬录实验⼀、培养基的配制和灭菌实验⼆、微⽣物的分离、接种及培养法实验三、⽔中细菌总数和⼤肠菌群的检测实验四、微⽣物的快速鉴定和⾃动化分析技术实验五、抗微⽣物药物敏感性试验实验六、微⽣物的⽣理⽣化反应实验七、微⽣物菌种保藏实验⼋、沉淀反应实验九、细菌鞭⽑染⾊及其运动的观察实验⼗、细菌芽孢、荚膜的染⾊及观察实验⼀、培养基的配制和灭菌⼀、实验⽬的1.了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的⼀般⽅法和步骤。
2.学习⼏种常⽤培养基的配制、分装和灭菌的操作⽅法。
3.进⼀步熟练掌握⼿提式⾼压蒸汽灭菌锅的使⽤⽅法。
⼆、实验器材1.药品及试剂：可溶性淀粉，葡萄糖，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，K2HPO4，1mol/L NaOH，琼脂，⽜⾁膏，蛋⽩胨，NaCl，马铃薯2.仪器及其它试管、三⾓瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、⾼压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、⽜⽪纸、记号笔、⿇绳、纱布、⼲燥箱、培养⽫、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH试纸三、实验内容1.分组配制⾼⽒⼀号培养基300ml。
配⽅：可溶性淀粉20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g 琼脂15-25g ⽔1000ml pH 7.4-7.62.配制⽜⾁膏蛋⽩胨培养基配⽅：⽜⾁膏3g 蛋⽩胨10g NaCl 5g ⽔1000ml PH 7.4-7.63.配制马丁⽒培养基配⽅：K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋⽩胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，⽔1000mL，⾃然pH。
配制⽅法配制20％马铃薯浸汁取去⽪马铃薯200g，切成⼩块，加⽔1000ml。
实验三培养基的配制及灭菌培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。
主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。
培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。
此外，为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的pH。
一般细菌、放线菌适于生长在中性或微碱性的环境中，而酵母菌和霉菌则适于生长在偏酸性的环境中。
因此，在配制培养基时，须将培养基调节在一定pH的范围内。
迄今为止，培养基的种类极其繁多。
按培养基的成分，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。
天然培养基是指利用动物、植物、微生物或其它天然有机成分配制而成的培养基。
其优点是营养丰富、价格便易；缺点是成分不能准确确定且不稳定。
实验室常用的牛肉汁或麦芽汁培养基即为天然培养基。
合成培养基是指完全利用已知种类和成分的化学试剂配制而成的培养基。
优点是各成分均为已知且含量稳定，缺点是价格较贵。
实验室常用的高氏一号培养基即为合成培养基。
半合成培养基是指由天然有机成分和已知化学试剂混合组成的培养基。
实验室常用的马铃薯葡萄糖培养基即为半合成培养基。
按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。
固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂（常加1.5％～2％的琼脂）经融化冷凝而成；半固体培养基是指在液体培养基中加入0.2％～1％左右的琼脂，经融化冷凝而成；液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。
按培养基的用途，可将培养基分为加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。
加富培养基是指在培养基中加入某些特殊营养物质，促使某种持殊性能的微生物迅速生长，有利从混合菌群中分离出所需种类微生物。
例如为了分离能够利用石蜡的微生物，常在培养基中加入石蜡作为碳源。
选择培养基是指在培养基中加入某些微生物生长抑制剂，抑制那些不需要的微生物的生长，以达到从混杂微生物菌群的环境中分离到所需的微生物。
