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gfp的应用原理步骤1. 简介GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）是一种来自于蓝绿色发光苔藓（Aequorea victoria）的一种蛋白质，它能发出绿色荧光。
GFP在生物领域具有广泛的应用，特别是作为荧光标记的工具，用来研究细胞生物学和生物化学等方面的问题。
本文将介绍GFP的应用原理步骤。
2. GFP的应用原理GFP的应用主要基于其特殊的结构和发光机制。
GFP的分子结构中包含一个环状的花青质染色体，通过紫外线或蓝光激发后，花青质染色体接受能量并发出绿色荧光。
GFP的应用原理步骤可以大致归纳为以下几个方面：2.1. GFP的基因表达与转染要应用GFP进行生物学研究，首先需要将GFP的基因导入到待研究的目标细胞中。
通常使用基因转染技术，将GFP基因导入细胞质或细胞核中，并使其被目标细胞所表达。
2.2. GFP的定位与追踪一旦GFP基因在目标细胞内表达成功，GFP蛋白质将被合成并定位在细胞的特定位置。
通过显微镜观察，可以实时追踪GFP蛋白的定位，揭示细胞器、细胞结构以及其他目标的位置和形态。
2.3. GFP的功能分析GFP的应用不仅仅局限于细胞定位的研究，还可以用于功能分析。
通过将GFP 蛋白与其他感兴趣的蛋白质进行融合，可以观察到蛋白质在细胞内的表达和功能活性，从而研究蛋白质的功能和相互作用。
2.4. GFP的动力学分析还可以利用GFP技术进行动力学研究，通过观察GFP蛋白在细胞内的动态变化，如运动轨迹、生长速度、参与细胞分裂等，揭示细胞的生物学过程和机制。
3. GFP的应用步骤应用GFP进行细胞生物学和生物化学研究的步骤如下：步骤1：选择适当的表达载体选择合适的表达载体，将GFP基因插入其中，并与目标蛋白的编码序列进行融合，以实现目标蛋白的表达和GFP的定位。
步骤2：转染目标细胞采用合适的转染技术将表达载体导入目标细胞，并使用适当的筛选标记（如抗生素抗性基因）筛选成功转染的细胞。
GFP的简介和应用【摘要】源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（GFP），是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。
本文就GFP的理化性质、荧光特性、改进以及它在科学研究中发挥的作用进行了综述。
【关键词】绿色荧光蛋白（GFP）、标记物、荧光特性、进展、改进、应用、干细胞移植【正文】一、GFP的简介1. GFP的理化性质，荧光特性及其改进1.1 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
Aequoria GFP分子量约27×103，一级结构为一个由238 个氨基酸残基组成的单链多肽；而Renilla GFP是分子量为54kD的同型二聚体。
两种GFP有不同的激发光谱，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；Renilla GFP在498 nm具有强烈的光吸收，肩峰为470 nm。
两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（λmax= 508~ 509 nm）。
GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
更重要的是，它们在很大的pH范围内的吸收、发射光谱也是相同的。
Renilla GFP的稳定性就更为显著。
它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。
根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT 蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。
1.2 GFP的荧光原理GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。
GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。
GFP基因及其应用研究一、GFP基因的发现和结构GFP是由Aequorea victoria这种海洋生物中发现的一种荧光蛋白质。
简单来说，GFP是由238个氨基酸组成的蛋白质，具有绿色荧光。
GFP蛋白质的分类基因为亚稳蓝蛋白基因，全长716bp，编码238个氨基酸，分子量为27kDa。
GFP的主要结构与功能区域包括：β桶、环绕色氨酸残基、环肽、或许存在的水分子和色氨酸区域。
二、GFP基因在生命科学中的应用1. 应用于细胞追踪和分化状态研究GFP基因已经被广泛用于细胞定位、示踪和分化状态的研究。
比如，在细胞定位方面，研究人员可以将GFP融合到要研究的蛋白质中，然后通过观察GFP的荧光信号来确定这种蛋白质在细胞内的位置。
2. 应用于药物筛选和评估GFP基因已经被发现可以用于药物筛选和评估。
比如，研究人员可以将GFP融合到需要研究的药物靶点上，然后通过观察GFP 的荧光信号来确定药物的有效性。
3. 应用于基因定位和功能研究GFP基因也被广泛用于基因定位和功能研究。
比如，在基因定位方面，研究人员可以将GFP融合到要研究的基因中，然后观察GFP的荧光信号来确定这个基因在细胞中的位置。
4. 应用于基因治疗GFP基因还可以用于基因治疗。
比如，在基因治疗方面，研究人员可以将GFP融合到需要治疗的细胞中，然后通过观察GFP的荧光信号来确定治疗效果和细胞存活情况。
三、GFP基因的优缺点1. 优点GFP基因是一种非常有用的基因，具有广泛的应用前景。
它的主要优点包括：绿色荧光信号容易被检测、可以被化学和物理变化激发、不需要外部底物、容易被光学显微镜观察和肉眼观察等。
2. 缺点尽管GFP基因有很多优点，但是它也有一些缺点需要考虑。
比如，绿色荧光信号的强度相对较低、GFP蛋白质的稳定性较差、特别是在高温、酸碱度大等条件下容易失活。
此外，GFP荧光标记的分辨率也有限制。
四、总结GFP基因是生命科学领域中的一种非常有用的基因，已经被广泛用于细胞定位、示踪、分化状态的研究、药物筛选和评估、基因定位和功能研究以及基因治疗等方面。
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
绿色荧光蛋白一、定义从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。
分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。
其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。
绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。
二、基本介绍绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，负责发光的基团位于桶中央，因此，绿色荧光蛋白可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。
装在“桶”中的发光基团对蓝色光照特别敏感。
当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。
利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。
原本黑暗或透明的视场马上变得星光点点——那是被标记了的活动目标。
对生物活体样本的实时观察，在绿色荧光蛋白被发现和应用以前，是根本不可想象的。
而这种彻底改变了生物学研究的蛋白质，最初是从一种广泛生活于太平洋海域的发光水母体内分离得到的。
在大自然中，具有发光能力的生物有不少，萤火虫是陆地上最为我们所熟悉的发光生物，我国古代还有“捕萤数百入囊内照明夜读”的佳话。
在海洋里，某些水母、珊瑚和深海鱼类也有发光的能力。
特别是有的肉食性鱼类专门靠一条闪着荧光的触角来把其他小鱼吸引到自己的嘴边，《海底总动员》里就有这种鱼。
事实上，大多数发光动物能发光是靠两种物质——荧光素和荧光素酶——合作产生的结果。
绿色荧光蛋白（GFP）在生命科学中的应用生命科学学院2011级2011012911 姜悦绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，最早是从华盛顿维多利亚水母体内克隆得到的。
GFP本身具有发光功能的荧光基团，无需特殊的辅助因子或其他蛋白的参与。
在近几年的生命科学研究中，GFP已经成为跟踪活组织或活细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物，这一方法日益成熟，成为基因转录调控、时相表达、蛋白质定位、转基因动物、细胞骨架等研究的有效手段。
GFP在组织中表达产生内在的荧光，从而可以标记一些正常的细胞学过程，再借助一些高分辨率的显微荧光光学仪器就可以监控这些动态过程。
一、GFP基因作为报告基因在生命科学中的应用GFP基因是一种标志基因，带有该基因的物种会发生荧光反应。
GFP基因往往与其他物种的功能基因一起植入实验物种的细胞，转基因得到的新物种如果出现荧光反应，则与GFP基因同时植入的其他物种的基因也应该存在于转基因物种的细胞内。
《海洋科学》2011年第35卷第9期报道的《杜氏盐藻叶绿体ATP合酶α亚单位基因启动子的克隆及初步功能分析》（谷辉辉，冯书营，潘卫东，李杰，薛乐勋）中就利用GFP基因作为一种报告基因。
目前, 虽然已经利用盐藻的核转化系统表达了一些外源基因，但是外源基因在细胞核转化时容易发生基因沉默、表达量低等现象，为此，研究者进行了转化盐藻叶绿体而非转化细胞核的尝试。
研究者采用DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、SmaI 和StuI六种内切酶消化杜氏盐藻叶绿体基因组DNA，与相应DNA接头连接, 构建成无载体连接的盐藻叶绿体GenomeWalker DNA文库。
利用长距离PCR技术从该文库中克隆得到ATP合酶α亚单位基因上游序列1347bp。
启动子特征分析显示该序列具有一般启动子的保守序列特征，根据这些特征设计引物，扩增4个5′端系列缺失的启动子片段，并用绿色荧光蛋白基因作为报告基因，构建启动子5′端系列缺失重组质粒，以期鉴定不同启动子片段驱动报告基因转录的活性。
应用GFP基因转染技术裸鼠体内示踪组织工程化骨袁捷，刘德莉，周广东，苗春雷，崔磊，刘伟，曹谊林（上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科，上海市组织工程实验室，上海 200011上海市组织工程研发中心，上海 200235）【摘要】目的应用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术，观察组织工程化骨体内形成过程中种子细胞的变化与转归。
方法用GFP重组逆转录病毒载体(GFP-RV)，转染犬骨髓间质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs），将其接种于β-磷酸三钙(β-TCP)，形成细胞-材料复合物，移植于裸鼠皮下。
术后8周，HE染色观察组织结构，碱性磷酸酶(AKP)染色和骨钙素(OCN)免疫组化检测功能蛋白，激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察。
结果8周后，大体可见组织工程化新骨形成，组织学示新生骨小梁围绕材料孔隙生成，AKP染色和OCN免疫组化结果阳性，并可见新生组织内有呈绿色的GFP标记细胞，β-TCP部分降解。
结论组织工程化骨组织学结构与松质骨小梁类似。
新生组织表达GFP，证实组织工程化骨组织的形成来源于供体细胞。
【关键词】重组逆转录病毒载体组织工程化骨绿色荧光蛋白β-磷酸三钙Use of GFP labelling to monitor tissue engineered bone formation in nude miceYUAN Jie, LIU De-li, ZHOU Guang-dong, et alDepartment of Plastic and Reconstructive Surgery, 9th People’s Hospital,Shanghai Tissue Engineering Center, SSMU, Shanghai 200011, China;Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center, Shanghai 200235, China 【Abstract】Objective To reconstruct tissue engineered bone with cultured bone marrow stromal cells(BMSCs) and trace it by green fluorescent protein(GFP) gene transfer. Methods Recombinant RV-GFP expression vector was used to infect canine BMSCs directly. GPF-labeled BMSCs were seeded onto beta-tricalciumphosphate(β-TCP) to form a cell-scaffold construct, then implanted into nude mice subcutaneously. Formed tissues were harvested at 8 weeks and evaluated by HE staining, AKP staining, immunohistochemistry of osteocalcin and confocal microscope. Results The tissue engineered bone had been formed over a 8-week period. There are newly formed trabeculae around the pore of β-TCP, AKP staining and immunohistochemistry of osteocalcin are positive.Confocal microscope revealed that GFP-labeled cells existed in many newborn tissue，β-TCP is partly degraded. Conclusion The results show that engineered bone are similar to spongy bone and the composed cells originated from cultured BMSC.【Keywords】recombinant retrovirus vector; tissue engineered bone ; green fluorescent protein; beta-tricalciumphosphate近年来骨组织工程研究中，骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSC)因获取时对机体损伤小、培养扩增后数量充足、且自体细胞避免了免疫排斥反应等特点，已经成为种子细胞的重要来源[1,2]。
BMSC在体外诱导培养下，能明显表现出一些成骨细胞的表型特征，如钙结节形成，碱性磷酸酶及成骨特异蛋白的表达，复合生物材料植入骨缺损部位一定时间后能成骨[3,4,5]。
但其植入体内后情况如何，是在各种因子的刺激下继续向成骨方向转化，最终形成新骨；还是自身逐步衰退凋亡，由周围组织中的成骨细胞或干细胞沿材料爬行替代成骨；或是两者兼而有之？这个问题—即种子细胞在体内成骨中究竟起何作用，还无直接的证据来证实。
本研究建立了一套完整的绿色荧光蛋白（GFP）基因标记BMSC的技术平台，该法可直接追踪植入的BMSC在体内的分化与转归，为阐明BMSC在裸鼠体内异位成骨的作用提供了直接证据，也为组织工程种子细胞的标记提供了一种简便、灵敏、可靠而又直观的方法。
材料和方法材料GFP逆转录病毒由本实验室自行构建[6]， PT67包装细胞，购自美国Clotech公司。
地塞米松、β－磷酸甘油钠和2-磷酸抗坏血酸、Polybrene购自Sigma公司。
G418购自上海华舜生物工程有限公司。
碱性磷酸酶（AKP）染剂BM-Purple购自宝灵曼公司。
骨钙素(OCN)免疫组化鼠抗一抗购自Chemicon公司，羊抗鼠二抗购自Dako公司，DAB显色液购自华美生物工程公司。
其它转染试剂及细胞培养试剂购自Gibco公司。
犬购自上海农学院，裸鼠购自上海肿瘤研究所。
β-磷酸三钙（β-TCP）购自上海贝奥路生物材料有限公司。
重组GFP逆转录病毒（GFP-RV）包装及扩增重组GFP-RV构建过程见文献[6]报导。
取生长状态良好的PT67【作者简介】袁捷（1976-），男，上海人，博士研究生【通讯作者】曹谊林，Tel:63138341-5192【基金项目】国家“973”组织工程基本科学问题项目(G1999054308)国家“863”组织工程化骨构建技术研究与产品开发(2002AA205011)上海市教委“重中之重”重点学科资助包装细胞接种到35 mm培养皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养18～24 h。
待细胞贴壁生长达70%融合时，弃去培养液，无血清培养基洗涤细胞1次，滴加含Lipofectamin（20μL）和质粒DNA（4.9μg）的无血清培养基1 mL，轻轻混匀，置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后更换普通培养液。
4d 后，用含400 mg/L 的G418培养液筛选。
抗性克隆初步形成后，观察其绿色荧光的强度，将抗性克隆移出，继续用G418培养基筛选，扩增至全部形成抗性细胞克隆，培养备用。
重组GFP-RV液的制备将抗性PT67细胞克隆，以含20%胎牛血清的DMEM培养液培养传代，收集含重组GFP-RV的PT67细胞上清培养液，以0.22μm无菌滤膜过滤，装入50 mL离心管内，于4℃储存备用。
BMSC的诱导培养与传代从杂交犬股骨大粗隆处无菌抽取骨髓3-4 mL，置于肝素化的离心管内。
经DMEM培养液洗涤，吸去上层脂滴，4%乙酸对倍稀释后，计数有核细胞，重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，以4×105个有核细胞/cm2的密度接种于培养皿中，加入含有地塞米松(10nM)、β－磷酸甘油钠(2.16g/L)和2-磷酸抗坏血酸(37.5mg/L)的成骨条件培养液，置37℃、5% CO2培养箱内培养。
4 d后BMSC克隆初步形成，用PBS洗去未贴壁的红细胞，更换培养液继续培养。
2～3 d后 BMSC大部分融合， 0.25％胰蛋白酶消化传代，传代后的细胞接种密度为0.5×104个细胞/cm2。
BMSC的转染传代后的BMSC增殖迅速，48 h便可达到80%融合，此时即可进行转染。
转染时去除原培养液，以无血清DMEM培养液洗涤1次，加入上述病毒液约10 mL/培养皿。
同时加入Polybrene (10 mg/L) 以增强转染率。
12 h后改用成骨培养液培养，待细胞完全融合，加入含300 mg/L 的G418培养液筛选并扩增抗性克隆。
BMSC的材料接种及体内回植转染GFP基因后的BMSC，体外继续扩增诱导一周，与等量未转染GFP，同时进行扩增与诱导的BMSC混匀接种到β-TCP上，接种密度为 1.5×107/cm3，继续培养诱导一周后，植入裸鼠一侧背部皮下。
以单纯β-TCP植入对称部位作为对照。
取材与检测术后8周取材，冰冻切片，一部分切片直接于激光共聚焦显微镜（上海第二医科大学组胚实验室）下观察GFP的表达。
另一部分切片0.4%多聚甲醛固定10分钟，PBS振洗3次，每次3分钟，再用AKP 磷酸缓冲液振洗10分钟（100mM Tris-Hcl-ph 9.5,100mM Nacl,10mM Mgcl2），滴加BM-Purple，置于室温下2小时，检测AKP的表达。
另一部分组织用4%多聚甲醛固定4小时，15%EDTA脱钙液脱钙后，石蜡切片一部分行 HE染色，观察新生组织的组织学形态。
另一部分切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，滴加3%过氧化氢30分钟（室温）， 0.05%胰酶消化30分钟（37℃），PBS缓冲液振洗3次，10%羊血清30分钟（室温），滴加OCN一抗4℃过夜，取出后滴加二抗30分钟（37℃），PBS缓冲液振洗3次，DAB显色5-10分钟，水洗后苏木素细胞核衬染，检测OCN的表达。
结果重组GFP-RV 病毒包装及扩增 GFP基因整合入PT67包装细胞基因组后，即可稳定表达GFP。
在蓝光(408 nm)激发下，荧光显微镜下可产生明亮的绿色荧光(508 nm)，(图1A)。
BMSC转染转染后，PT67包装细胞上清液中，含有完整包膜蛋白的病毒。
用此病毒可直接感染BMSC，经G418筛选一周后其表达率可达90%以上，在荧光显微镜下，可产生明亮的绿色荧光(图1B)。
