冰冻切片免疫组化

实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）免疫组化的原理说起来其实挺简单的，抗原抗体反应嘛，通过采用显色剂来标记抗体，进行化学反应后便能显色，从而确定出组织细胞中的抗原。

可以进行定位、定性以及定量。

石蜡切片或者冰冻切片均可以做免疫组化的实验，前期的过程会有所不同：石蜡切片：取出需要实验的石蜡切片，先进行脱蜡处理，最后置于自来水中备用。

对于冰冻切片，无需上述步骤，直接从-20℃冰箱中取出即可进行后续的操作啦~~~接下来的步骤就全部一样啦~~~抗原修复：由于我们在制备石蜡切片或者冰冻切片时，采用福尔马林进行固定，会使得组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛建，使得不少抗原决定簇被封闭；采用多聚甲醛会具有聚合作用，均阻碍了抗原和抗体的结合。

所以我们怎么着都要进行这步哒，虽然比较耗时。

言归正传，具体的抗原修复液为：0.51 g 柠檬酸钠0.095 g 柠檬酸双蒸水定容至250 mL偷偷告诉你可以偷懒的，配置为10×抗原修复液后，每次实验稀释后使用就可以了。

配置好修复液后，将切片置于其中，采用微波修复法修复（中火，5 min），取出后冷却至室温（一般放在4℃冰箱冷却更快），再进行如上微波修复后冷却，一共三次。

阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢（30%过氧化氢，采用甲醇稀释10倍即可得到）中10 min即可。

随后采用1×PBS洗三次，每次5 min。

抗原抗体反应步骤：这部分内容就会因使用的试剂盒的不同而略有差异了，我使用的是中杉金桥的二步法试剂盒，过程比较简单，接上一步骤后直接加一抗（1×PBS稀释）4℃孵育过夜。

第二天洗一抗（1×PBS洗三次，每次5 min）后加二抗室温孵育半小时后，同上洗三次。

Tips: 有些试剂盒会需要先用血清封闭后再加一抗孵育的。

还有哦，孵育要在湿盒中哦，不然全挥发咯会。

DAB显色：这步挺关键的，显色的时间把握很重要，显色过度会颜色太深而观察不到有效的结果，时间过短也会显色不完全。

冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。

取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。

冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。

也可根据需要选择其它的固定方式。

PBS洗，5分钟×3。

用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×3。

下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。

石蜡切片免疫组化染色步骤三步法（以SP试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。

2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。

3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。

4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5. PBS冲洗，2分钟×3次。

6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

7. PBS冲洗，2分钟×3次。

8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

9. PBS冲洗，2分钟×3次。

10. 显色剂显色（DAB或AEC）。

11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。

二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。

1 冰冻切片4~8um,室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟另：丙酮先在-20C 预冷,然后在4C固定片子15分钟,固定后在室温下干燥后再做免疫组化,PBS洗,5分钟×3;
2 用3％另 %过氧化氢孵育5~10分钟另：最好是用3%H2O2/甲醇溶液,室温20分钟;此配方不易产生脱片;配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml,混匀后使用,每次新鲜配制,消除内源性过氧化物酶的活性;PBS洗,5分钟×2;
3 5~10％正常山羊血清PBS稀释封闭,室温孵育10分钟;倾去血清,勿洗,
4 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜;
5 回收一抗,PBS冲洗,5分钟×3次;
6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗1%BSA-PBS稀释,37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟;
7 PBS冲洗,5分钟×3次;
8 显色剂显色DAB或AEC;
10 自来水充分冲洗,复染,封片;
如果你的组织曾放在多聚甲醛中固定的话,建议还是抗原修复效果比较好,如果没在甲醛中浸泡,无需抗原修复;
如果你的片子切完后在冰箱中保存的话,做之前,从冰箱取出后先室温半小时,然后入37℃烤箱一小时,再进行免疫组化实验,掉片现象会少一点;我们以前片子从-20℃取出后,接着就做免疫组化,片子掉得很多;。

⾸先呢，⼀定需要单独说说术中冰冻切⽚和免疫组化！（该部分内容如果班门弄斧了，请⾃⾏跳免疫组化免疫组化，是对抗原进⾏定位、定性或定量研究。

利⽤抗原和抗体特异性结合的原理，免疫组化通过标记抗体的着⾊剂显⾊（酶、荧光素、同位素、⾦属离⼦等），确定组织细胞内的抗原（主要是多肽和蛋⽩质）。

免疫组化的常⽤标本主要是两⼤类：组织标本和细胞标本，⽽制作组织切⽚的最常⽤⽅法是⽯蜡切⽚。

在临床病理诊断中，免疫组化发挥了重要作⽤：判断肿瘤的良恶性；对恶性肿瘤进⾏明确的分期；对细胞的属性进⾏判定，确定肿瘤的来源；对来源不明的转移瘤，进⼀步明确其原发部位；对未分化恶性肿瘤进⾏组织学分类；对不同器官与组织交界处肿瘤进⾏分类；发现微⼩转移灶；与治疗及预后有关的免疫组化标记物；⽤于检测及诊断多种感染性疾病病原微⽣物，具有很强及时性、⾼敏感性和特异性；药物靶点免疫组化可以确定药物治疗的靶点，进⾏疗效评价并预测后续的的治疗反应[1]。

传统免疫组化⽅法采⽤⽯蜡切⽚，检测过程包括脱蜡⾄⽔、抗原修复、⼀抗、⼆抗孵育、洗脱、显⾊等步骤，较为复杂，耗时最短亦需要3⼩时。

我们都知道，常规的免疫组化根本⽆法在⼿术过程中做到快速诊断。

术中冰冻切⽚快速免疫组化了解了术中冰冻切⽚和免疫组化的优势和局限，再来说明术中冰冻切⽚快速免疫组化⼤家就很容易理解了！术中冰冻切⽚快速免疫组化就是结合了⼆者的优势，可在短时间内通过对特殊指标的免疫组化染⾊来明确诊断的⼀种病理检测技术。

看到这⾥，对这个有点炸裂式的「化学反应产物」你是不是有不少疑问：1、这是啥原理啊？如何能实现快速免疫组化？2、检测过程⼀般需要多久？3、诊断准确率怎么样？接下来这些问题将⼀⼀作答！欢迎个⼈形式转发，谢绝媒体、⽹站等未经允许以任何形式转载⾄其他平台；如需转载请提前联系本公众号，并在⽂⾸注明「来源：衡道病理」。

冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。

该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。

本文将详细介绍这些步骤。

二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。

比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。

2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。

固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。

3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。

脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。

4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。

三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。

这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。

2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。

这一步需要注意，避免样品受到外界污染。

四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。

这一步可以通过加热或酶解等方式实现。

2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。

常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。

3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。

这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。

4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。

观察过程需要使用荧光显微镜进行。

五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。

该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。

在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。

冰冻切片免疫组化步骤
1.从-20°取出片子平衡到室温
2.PBS洗2min 3遍
3.0.3%H2O2 10min（避光）--用PBS将30% H2O2稀释100倍
4.PBS洗2min 3遍
5.10%FBS封闭30-60min（室温）；可以配置10%FBS约10ml，用PBS稀释
6.一抗（10%FBS配置），60min，室温孵育（注意封闭后不用洗！）
7.PBS洗2min 3遍
8.1‰链霉素（带HRP）30min 室温孵育，同样链霉素用10%FBS稀释；若为二抗则也是
用10%FBS稀释，接着孵育半小时。

9.PBS洗2min 3遍
10.将玻片擦拭干净，带组织部分保持湿润，DAB显色（bufferA 1ml + bufferB 1滴），用1ml
枪加在载玻片后，进行镜下观察，待特异性蛋白显色适当时，用PBS洗去DAB。

11.苏木素2min （待染色效果改变颜色）
12.1‰盐酸乙醇分化（迅速刷三次）
13.PBS水中洗净有机溶剂
14.75%、80%、95%、100%酒精脱水
15.二甲苯2min
16.二甲苯2min
17.中性树脂封片
Ps:盖玻片先用盐酸乙醇刷一下，然后用水洗干净，最后泡在二甲苯里，在封片前用无尘纸头擦干净，再封片。

说明一抗配置，如果一抗为100ug（RD）则可以加入100ul的pbs，使浓度在1ug/ul，同时分装抗体。

免疫组化步骤1.检测标本免疫组织化学技术可用于检测石蜡切片、冰冻切片及细胞涂片。

大部分抗体可用于石蜡切片，而适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片和细胞涂片。

冰冻切片的优点是能够较好的保存组织抗原，但是缺点也很明显，组织形态结构较差，定位不是很清晰。

石蜡切片的优点是组织形态结构好，定位清晰，但是在样品的处理过程中容易破坏组织抗原[4]。

下面主要是围绕实验室常用的石蜡切片的操作进行总结。

2.组织固定组织离体后应立即进行固定，尽可能保存组织细胞内的抗原成分和原有的形态结构，防止组织抗原弥散。

固定的方式多采用固定液浸泡组织，常用的固定液是甲醛，固定液的浓度是4%甲醛溶液（10%福尔马林溶液，PH7.2-7.4），固定液用量大概是组织的10-20倍，标记的组织块不宜过大。

判断组织是否固定良好，可以取出已经固定完毕的组织标本用刀切开，如固定良好，其切面呈灰白色，质感较硬而具有弹性。

3.组织脱水从固定液中取出的组织，建议用流水冲洗，去除过多的固定液和组织所产生的分解产物，避免污染组织。

组织脱水的目的是使得组织内的水分逐步被替换出来，因为组织制成蜡块是要求组织要被熔化的石蜡所浸透，因为石蜡和水不相溶，脱水干净后才有助于下一步组织的浸蜡。

脱水一般采用从低到高浓度乙醇脱水，组织经过70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，其中95%乙醇和100%乙醇经两缸试剂脱水。

4.组织透明组织透明的目的是把脱水剂乙醇将组织内用透明剂（二甲苯）置换出来，以利于熔化的石蜡进入组织，组织经脱水透明后，肉眼可见整块组织呈透明状，没有白色浑浊的状态，常用的透明剂是二甲苯，在室温透明时间，组织透明时间以30-60分钟为宜，不宜过长，依据组织的大小肉眼观察组织适当调整透明时间。

5.组织浸蜡和包埋常用的包埋剂是石蜡，石蜡在60-62℃电热恒温箱内保持熔化状态，将组织在其内浸透一定时间，一般组织一般为2-4小时，分2缸石蜡按顺序进行操作。

冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。

它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。

本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。

步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。

2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。

步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。

2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。

3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。

步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。

2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。

3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。

步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。

这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。

2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。

步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。

2.孵育时间通常为30分钟至1小时。

步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。

2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。

步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。

2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。

步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。

2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。

步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。

冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。

（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。