第十二章 制备型高效液相色谱技术 生物制药工艺学

生物制药工艺学一、离心技术1. 制备超离心三种转子P3182. 制备超离心三种离心方法P3203. 沉降速度和沉降系数 P328 ①沉降速度：即在离心力作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。

②沉降系数：即物质粒子在单位离心场中的沉降速度，量纲为秒。

一般所说沉降系数为S 20,w 。

4. 分析超离心的两种方法 P331 Svedberg 方程式：测分子量实质是用不同方法测其沉降速度。

原理测量量沉降速度法根据沉降速度测出沉降系数以推出分子量。

界面位移量与离心时间。

沉降平衡法特定平衡下,离心力与扩散力平衡，液面浓度为0，池底浓度为2c 。

任意两位移处的浓度。

5. 超离心的其他两种应用P334①对生物大分子的均一性估计；②生物分子形状、大小及水合度的判断。

二、膜分离技术1. 各向同性膜与各项异性膜P341①各向同性膜：厚度大，孔隙为圆柱体。

流速低，易堵塞。

②各向异性膜：1）正反两面结构不同：功能层是孔径一定、薄的“皮肤层”，支持层为孔隙大得多、更厚的海绵层；2）喇叭口滤膜，孔隙为圆台形。

2. 截留分子量P343分子量截留值是指阻留率达90%以上的最小被截留物质的分子量。

3. 浓差极化现象P346超滤是在外压作用下进行的。

外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，大分子被截留在膜表面，并逐渐形成浓度梯度，产生浓差极化现象。

✘害处：引起流速下降、影响膜的选择透过性。

✔解决方法：振动、搅拌、错流、切流等技术。

4. 五种微孔滤膜P3555. 三种测微孔滤膜孔径的方法P3566. 微孔滤膜的应用P361①mRNA的测定以及纯化：使用硝酸纤维膜吸附与mRNA配对的DNA单链，然后将放射性mRNA样品溶液过膜使目的mRNA与DNA单链配对结合。

最后洗涤游离RNA，并用胰核糖核酸酶处理除去残留RNA。

②环状DNA的纯化环状DNA链打开后，变为一条环状链和一条单链。

用硝酸纤维膜结合单链，而环状链过膜，即可纯化得到环状单链DNA。

第十二章制备型高效液相色谱技术一、填空1制备型高效液相色谱的重要参数：、、、2色谱介质按分离机理分为、、、、、3蛋白质分离的主要依据有、、、。

二、选择题1用UV检测器进行多肽检测时常用的检测波长为：（）A 214nmB 320nmC 450nmD 500nm2在高效液相色谱中,六通阀属于 ( )A. 进样系统B. 分离系统C. 检测系统D. 数据处理系统三、名词解释1容量因子：2分离度：四、问答题1 制备型HPLC与分析型HPLC的主要不同点是什么？2简述制备型高效液相色谱常见问题及解决办法3一般来讲在设计分离方案时应考虑哪些事项？第十二章 制备型高效液相色谱技术 （答案）二、 填空1分离度、分离速度、回收率、样品载量2反相色谱、 正相色谱、 离子交换色谱、 凝胶过滤色谱、亲和色谱 。

3分子量、等电点、疏水性、结构特异性 。

二、选择题1（A ）2 ( A )三、名词解释1是色谱分析中的重要参数，定义为溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。

当色谱柱、溶剂和分离温度一定时，容量因子为常数。

2在色谱分析中,表示各组份之间分离程度的参数.其定义为相邻两色谱峰保留值之差与峰底宽之和一半的比值.2121)(2)(211212W W t t W W t t R r r r r +-=+-=四、 问答题1 （1）输液泵不同： 两种泵设计的特点及其性能（2）检测器中的检测池不同（3）色谱柱不同：主要是色谱柱的直径大小不同以及填料的粒径的大小不同（4）制备色谱一般配有电导检测器和pH 值检测器分析型色谱没有（5）制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有2（1）待分离成分呈单一主峰（2）不易分开的两组分（3）目的组分含量少3 （1） 产品的最终用途是什么?（2）那种原材料可以得到？怎样对它进行预处理? （3）在原材料中那种杂质可能会影响产品的纯度? （4）哪些杂质必须彻底除去?（5）产品的最终生产规模是多大?（6）在整个生产过程中哪些方面费用高?（7）我们可能得到和应用的仪器有哪些?。

01396生物制药工艺学.doc湖北省高自考考试大纲课程名称：生物制药工艺学课程代码：01396（理论）第一部分课程性质与目标一、课程性质与特点该课程是，是一门涉及生物学、医学、药学、生物技术、化学和工程学等学科基本原理的综合性应用技术科学。

使学生了解生物药物的来源及其原料药物生产的重要途径和工艺过程，掌握生物药物的一般提取、分离纯化原理与方法，了解各类生物药物的结构、性质、用途和生产方法、生产工艺原理与过程。

通过本课程的各个教学环节的学习，学生应具备生物药物研究、生产、开发的基本知识、基本理论与基本技能，并且具有应用现代生物技术研究、开发生物药物的初步能力。

二、考核知识点与考核目标（一）细胞破碎的方法及原理（重点）识记：常用细胞破碎的方法理解：细胞破碎的方法和各自特点、适用范围应用：举例说明不同生物材料的细胞破碎方法（二）生物材料的预处理（次重点）识记：凝聚作用和絮凝作用的概念理解：细胞培养液的预处理方法和相关原理，去除杂蛋白和金属离子的方法和原理应用：影响絮凝效果的主要因素（三）了解液固分离的方法和设备（一般）识记：过滤和离心分离的概念理解：影响液固分离的因素有哪些应用：错流过滤的使用特点；碟片式离心机的类型和特点第四章萃取分离法一、学习目的与要求掌握溶剂萃取的基本原理，萃取方式，破乳化方法；熟悉萃取设备和溶媒回收方法掌握超临界萃取的原理，影响因素；了解超临界萃取方式及流程掌握双水相萃取原理和影响因素了解反胶束萃取原理及其在生化药物分离纯化中的应用二、考核知识点与考核目标（一）萃取法的基本原理（重点）识记：溶剂萃取法、双水相萃取、反胶束萃取、超临界流体萃取的概念理解：各种萃取方法的特点应用：举例说明不同萃取法的应用（二）溶剂萃取法的操作方式（次重点）识记：乳化和破乳化的概念理解：影响溶剂萃取的因素应用：破坏乳状液的方法（三）超临界流体萃取在生物制药领域的应用（一般）识记：超临界萃取概念理解：超临界萃取的原理和影响因素应用：超临界萃取方式及流程和超临界流体萃取在药品生产中应用第五章固相析出分离法一、学习目的与要求掌握盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法等固相析出分离方法的原理和特点，以及影响因素。

制备型高效液相色谱法及其在中药研究中的应用一、本文概述制备型高效液相色谱法（Preparative High Performance Liquid Chromatography, Prep-HPLC）是一种重要的色谱分离技术，以其高效、快速、自动化的特点在多个领域，特别是中药研究中发挥着越来越重要的作用。

本文旨在全面介绍制备型高效液相色谱法的基本原理、技术特点以及其在中药研究中的应用情况。

文章将概述制备型高效液相色谱法的基本原理和操作流程，包括色谱柱的选择、流动相的优化、样品的制备和分离等关键环节。

文章将重点讨论制备型高效液相色谱法在中药研究中的应用，包括中药成分的分离纯化、质量控制、药物代谢动力学研究等方面。

文章还将对制备型高效液相色谱法在未来的发展趋势和挑战进行展望，以期为相关领域的科研人员提供有益的参考和启示。

二、制备型高效液相色谱法的基本原理与技术制备型高效液相色谱法（Preparative High Performance Liquid Chromatography，Prep-HPLC）是高效液相色谱法（HPLC）的一个重要分支，它主要用于大规模分离、纯化和制备样品。

其基本原理基于混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配平衡，通过高压泵将流动相推动，使待测样品在固定相和流动相之间不断进行吸附、解吸、再吸附的分配过程，从而实现各组分的有效分离。

制备型高效液相色谱法通常使用更粗的色谱柱和更高的流速，以实现更大规模的分离和制备。

与分析型高效液相色谱法相比，制备型高效液相色谱法更注重样品的纯度和回收率，而不仅仅是各组分的定性和定量分析。

在制备型高效液相色谱法中，选择合适的固定相和流动相至关重要。

固定相的选择应根据样品的性质和目标组分的特性来确定，常用的固定相包括硅胶、氧化铝、聚合物等。

流动相的选择则要考虑其与固定相的相容性、对目标组分的洗脱能力以及分离效果等因素。

制备型高效液相色谱法还涉及到柱层析、梯度洗脱、循环洗脱等技术。

·综述·制备型高效液相色谱在生物医药制品领域的应用杨国锐，杨晓彤，杨庆尧制备型高效液相色谱（preparative high performance liquid chromatography，Prep-HPLC）是一种使用高压、大流量液体输送系统在高分辨率、大内径、高载量分离柱上进行样品高纯度分离的液相色谱制备方法。

应用该方法分离的产品在纯度、回收率、分离效率等方面远远优于传统的制备方法，因此在生物制品和药物研究、生产领域得到广泛应用[1-3]。

本文就近年来 Prep-HPLC 方法的研究进展及其在生物医药制品领域的应用做一综述。

1 Prep-HPLC 在蛋白质和多肽分离制备中的应用蛋白质和肽类药物活性强，生物功能明确，特异性高，有利于临床应用，已成为医药产业中的一大类重要产品。

但这些产品无论是来自于生物体内还是由化学合成，往往都带有复杂的混合成分，而总目的蛋白或肽类的丰度又低，给分离纯化带来困难，需要多种方法联合使用以获得纯度满意的产品。

在此过程中，Prep-HPLC 通常在分离的最后阶段被用作获得高纯度产品的关键方法[4]。

使用 Prep-HPLC 制备前，蛋白质和肽类样品一般先经过传统分离纯化方法，如盐析、超滤法、凝胶过滤、等电点沉淀、离子交换层析及亲和层析等，预先提高纯度，然后再进行高纯度制备。

使用比较普遍的色谱柱是烷基反相键合柱，如 C18、C8 及 C4 等，具体选择因蛋白质相对分子质量或疏水性而定。

流动相大多为甲醇或乙腈等有机相与水的混合体系，通常还添加三氟醋酸（trifluoroacetic acid，TFA），以增加样品的溶解度。

黄鹤等[5]用 C18 柱（100 mm × 8 mm，5 µm）对经离子交换层析后的胸腺素α-1（T 细胞免疫增强剂，为酸性较强的 28 肽）半纯品进行了纯化，流动相采用 0.1% TFA/水和 0.1% TFA/90% 乙腈溶液梯度系统，可将制备前约65% 的纯度提高到 95% 以上，回收率可达 60%。