细菌分离与纯培养

细菌的分离培养与纯培养实验报告一、实验目的本实验旨在掌握细菌的分离培养方法，了解纯培养的原理及方法，以及熟悉细菌培养基的制备和使用。

二、实验原理1. 细菌分离培养方法细菌分离培养是指将混合菌落中的单一细菌分离出来，使其在无竞争的环境中独立生长。

常用的方法有均匀涂布法、斜坡涂布法和点式涂布法。

2. 纯培养原理及方法纯培养是指将混合菌落中同一种细菌分离出来并进行单独培养。

常用的方法有挑选法和稀释法。

3. 细菌培养基制备与使用细菌培养基是供给微生物生长发育所需营养物质和条件的一种人工环境。

根据不同需求可制备不同类型的细菌培养基，如寒偏好性、厭氧性、选择性、差异性等。

常用的细菌培养基有普通营养琼脂平板、LB 平板等。

三、实验步骤1. 细菌分离培养（1）取一支无菌的铂丝，将其消毒并冷却。

（2）取一份混合菌落，将铂丝在其表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。

（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上。

（4）重复以上步骤，涂布多个琼脂平板。

（5）将琼脂平板放置于恒温箱中，在适宜的温度下培养。

2. 纯培养（1）取一份混合菌落，在显微镜下观察并挑选出同一种细菌。

（2）取一支无菌的铂丝，在混合菌落表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。

（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上，并进行单独培养。

3. 细菌培养基制备与使用（1）按照需要制备不同类型的细菌培养基，并进行消毒灭菌处理。

（2）将需要进行分离或纯化的混合菌落均匀涂布于培养基上，进行培养。

四、实验结果1. 细菌分离培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上出现单一的细菌菌落。

2. 纯培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上只有挑选出的同一种细菌菌落。

3. 细菌培养基制备与使用制备好的细菌培养基可用于分离、纯化和大量繁殖特定细菌。

五、实验注意事项1. 实验器材需消毒并严格无菌操作。

2. 均匀涂布法需注意铂丝在琼脂平板上均匀涂布。

3. 液体培养基需注意摇晃均匀以使细菌均匀分布。

4. 实验结束后要彻底清洗和消毒实验器材和工作台面。

土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。

2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。

4. 学习平板菌落计数法。

二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。

要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。

微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。

表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。

3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。

4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。

4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。

（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

盛土的容器应是无菌的。

将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。

实验 3 微生物的纯种分离培养微生物广泛地分布在自然界的土样、水体、空气、动植物体表及人体、动物体的排泄物中。

它们以单个的菌体、无性孢子和芽孢的形式存在。

由于单一的自然界环境并不能完全满足微生物对水、空气、营养物质、温度、pH的综合要求，它们往往以散居”的状态出现，而不能形成人们肉眼可直接观察到菌落。

不同的自然环境中，微生物的种类和数量差异很大。

肥沃的土壤，富养化的水体，是许多微生物麇集、孳生的场所，在这里存活着能分解淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素、木质素、果胶、农药、含磷有机物（卵磷脂、肌醇、核酸等）、石油以及溶解铜矿的细菌、放线菌、真菌等多种类的微生物，如何根据微生物的生理要求，按照人类的需求，将它们从自然界中分离出来，获得纯种，发挥微生物的特长为人类的生产和生活服务，是微生物研究中最基础的实验技术。

一、实验目的：1．学会将混杂的各种微生物分离成纯种，统计分析样品中微生物的种类和数量的方法。

2．学会从菌落及培养特征区分细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。

3．学会好氧微生物平板及斜面培养的方法。

二、实验原理：在自然界中，微生物的种类很多，数量很大，为了获得单个菌体，首先必须把要分离的材料进行适当的释放，按其生长所需要的条件，使其在平板上，由一个菌体繁殖成单个菌落，这样，就能从中挑选出所需要的纯种，由于细菌、放线菌和霉菌所要求的营养条件不同，利用不同的培养基制成平板进行分离，然后从菌落形态上的差异，可以把细菌、放线菌和霉菌三大类群区分并可计算出其数量，分别接种到试管斜面上，然后，在平板上反复进行分离培养，最后可获得纯种。

三、实验材料和用具：1．材料（1）土壤样品（ 2 ）培养基：①牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基（% ）牛肉膏0.3-0.5g 蛋白胨1.0g NaCl 0.5g 琼脂2.0g 蒸馏水100mL pH 7.2-7.4 ，0.1Mpa 压力，灭菌20-30分钟。

配制液体培养基时不加琼脂；半固体培养基加0.3-0.5%琼脂。

微生物菌种的分离和纯化方法1.空气平板法空气平板法是一种常用的微生物菌种分离方法。

将待分离的微生物样品进行适当的稀释并均匀涂布在含有经过固化的琼脂平板上，然后放置在适宜的温度下进行培养。

微生物在平板上呈现为单个菌落，每个菌落都代表一个来自单一细胞的微生物。

通过挑取单个菌落，将其再次传代培养，最终可以得到纯净的菌种。

2.稀释平板法稀释平板法也是一种常用的微生物菌种分离方法，在空气平板法的基础上进行了改进。

先将待分离的微生物样品按一定比例稀释，然后将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上。

由于稀释后的样品中菌落之间的距离更远，因此每个菌落代表的是来自更少数的微生物细胞，得到纯净的菌种的几率更高。

3.前体菌种法前体菌种法是一种通过选择性培养基将目标微生物分离出来的方法。

选择性培养基可以通过添加特定的抗生素、酸碱度调节和特定营养物等来抑制其他微生物的生长而促进目标微生物的生长。

将待分离的微生物样品进行适当的稀释后接种在选择性培养基上，利用培养基的选择性促使目标微生物生长并抑制其他微生物的生长，最终得到纯净的菌种。

4.形态学分离法形态学分离法是一种根据微生物在形态和结构上的差异进行分离的方法。

先选择合适的培养基和培养条件，将待分离的微生物样品进行培养。

在培养过程中，观察并挑选出形态和结构上有明显差异的微生物，然后将其进行单菌维持培养，并通过形态特征进一步分离和纯化菌种。

5.生理生化特性分离法生理生化特性分离法是一种根据不同微生物菌株在代谢和物质转化方面的差异进行分离的方法。

根据微生物菌株的生理生化特性，如生长速度、氨基酸利用能力、产酸产气等，将微生物菌株进行初步分离，然后通过进一步的生化鉴定和特性测试，最终得到纯净的菌种。

总结起来，微生物菌种的分离和纯化方法有很多种类，选择合适的方法依赖于待分离的微生物特性和研究目的。

这些方法在微生物学的研究中起到了关键作用，为了获得纯净的微生物菌种提供了有效的手段。

普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求1了解分离与纯化微生物的基本原理及方法;2掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术;3掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法;二、基本原理植物病原菌的分离培养,是植物病理实验室工作中的基本技能;为了获得某微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜的生活条件,即让病原菌生活在适宜的培养基上,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而得到纯菌株;植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种;最常用的方法是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离;病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用,在有些情况下也采用稀释分离法;为了获得分离菌的纯培养,必须要进行分离菌的纯化,纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法;三、材料、仪器与用具1．材料依当地情况进行选择,下列材料供参考1稻瘟病叶、病节、病穗颈pyricularia orycae;2玉米大斑病叶exserohilum turcicum;3玉米弯孢菌叶斑病叶curvularia lunata;4玉米小斑病叶bipolaris maydis;5番茄灰霉病果botrytis cinefca;6黄瓜菌核病果sclerotinia sclerotiorum;7黄瓜细菌性角斑病叶pseudomonas syringaepv．1achrymans;8水稻白叶枯病叶xanthomonas campestms pv.oryeue;9大豆细菌性斑点病叶pseudomonas syringaepv．glycinea;10白菜软腐病叶erudnia carotovora subsp．carotovora;2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等;3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲针、接种环铒、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等;0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml;先将升汞溶于盐酸中,待充分溶解后,再加水稀释;升汞是剧毒药物,在操作时应特别小心;四、实验操作一病原真菌的分离1．组织分离法按照以下步骤进行：1取灭菌培养皿一个,置于湿纱布上,在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名;提示：为了保证无菌操作,应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内,工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净,工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中,特别在使用无菌操作间时,呼吸要轻,不要说话;2用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴可减少细菌污染,然后将融化而冷至60c左右的pda培养基倒人培养皿中,每皿倒10--15ml,轻轻摇动使之成平面;凝固后即成平板培养基;提示：加入25％乳酸1～2滴,可基本保证平板上不出现污染细菌苗落;除乳酸外,在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长,也是常用的方法;加青霉素20μg／ml可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b5．0μg／ml可以抑制g—细菌生长；加链霉素40μg／ml或氯霉素50μg／ml可以抑制大部分细菌的生长;除了氯霉素可在灭菌前加入外,其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右以手背触三角瓶感到烫,但尚可以忍耐为宜’时加入;倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领,不必在火焰上方,一般很少污染;3取真菌叶斑病的新鲜病叶或其他分离材料,选择典型的单个病斑,用剪刀或解剖刀从病斑边缘病健交界处切取小块海边长3--4mm病组织数块;提示：选择新患病的组织作为分离的材料,可以减少腐生菌混入的机会;腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生,因此,一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离;4将病组织放人70％酒精中浸3—5s后,按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5rain也可使用其他表面消毒剂,如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短；反之则可长些;然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留的消毒剂;提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡,减少表面张力,70％的酒精亦用于表面消毒,处理的时间较短一般数秒至lmin;升汞溶液消毒的时间因材料而异,可自30s至30min不等,一般情况下,需时间3,5min;5用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放4--6块;提示：在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水,以大大减少病组织附近出现细菌污染; 6将培养皿倒置放人2512左右恒温箱内培养;一般3—4d后观察待分离菌生长结果;7若病组织小块上均长出较为一致的菌落,则多半为要分离的病原菌;在无菌条件下,用接种针铲自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上,在25℃左右恒温箱内培养,数日后,观察菌落生长情况,如无杂菌生长,即得该分离病菌纯菌种,便可置于冰箱中保存;提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外,还要在显微镜下检查,进一步确定;如果是对未知病原菌的组织分离,则要将长出的蕾落分别转出,通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌;在组织分离工作中,如果植物材料体积较大且较软如患灰霉病的番茄果实,在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上,完成分离工作;2．稀释分离法1取灭菌培养皿三个,平放在湿纱布上,编号,并注明日期、分离材料及分离人姓名;2用灭菌吸管吸取灭菌水,在每一皿中分别注入0．5～1．0ml;3用移植环蘸一滴孢子悬浮液,与第一个培养皿中的灭菌水混合,再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中,混合后再移三环到第三个培养皿中;4将熔化开冷却到45～50c的培养基,分别倒在三个培养皿中为防止细菌污染,也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸,摇匀,凝固,要使培养基与稀释的菌液充分混匀;提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好,过热易将病原菌烫死而使分离失败,过冷则倒入培养皿中后难以形成平板,而成为起伏不平的表面,不利于分离;为大体估计培养基温度,可将盛培养基的器皿靠在人手背上,如果手背感到烫但尚可以忍耐,则大体为45~50c;5将培养皿翻转后置恒温箱2513中培养,数日后观察菌落生长情况;6挑菌;将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取,接种到斜面培养基上,置25℃左右培养;待菌长出后,检查菌是否单纯,若有其他菌混杂,就要再一次进行分离纯化,直到获得纯株培养;二病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用;在进行分离之前,首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断,即经过镜检确认有喷菌现象以后,才对该病组织作分离工作;稀释分离法是最经典的标准分离法,方法同上述真菌分离;除去上述稀释分离法以外,较为方便的是划线分离法：1预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中,凝成平板后,翻转放在30c恒温箱中2—4h,使表面无水滴凝结;也可凝成平板后直接使用;2将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min,再用无菌水换洗3次后,放在灭菌培养皿中的灭菌水中,用灭菌玻棒研碎,并让组织碎块在水中浸泡20—60min,让细菌释放到灭菌水中; 3用灭菌的接种铒接种环蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线,尽量不要把平板表面划破;划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线;灭菌后再划第三次线;提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要,这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大;4用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后,翻转培养皿,放在26～28c恒温箱中培养;1—3d后观察有无细菌生长,在哪些地方有单菌落生长出来其中的优势单菌落应为待分离菌形成的;5仔细挑取病原菌的单菌落,并移植到斜面培养基上;同时,再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离,经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致,并与典型描述的特征相一致时,即表明已获得纯培养;最好要经过连续三次单菌落的分离,才能确保纯化;三真菌、细菌培养性状观察1．真菌培养性状观察取已分离、纯化的某种真菌菌种,按前述稀释分离法中1--5步骤进行,待某培养皿中形成单个菌落后观察;记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等;同时要记载培养基种类成分及ph 和培养温度、光照条件;2．细菌培养性状观察1仿照上述真菌菌落形成步骤,观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,菌落生长速度快慢,是否有特殊气味形成等;同时要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;2用接种铒环蘸细菌菌种后,通过无菌操作在肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线,过2～3d后长出的细菌群体称为菌苔,可仿照观察记载细菌菌落的记载内容,记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,是否有特殊气味生成,生长速度快慢等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;3用接种铒环蘸取细菌菌种后,通过无菌操作,将其接种在某种液体培养基中,数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成,培养液表面是否可生成菌膜等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;五、所需时间流程1．病原真菌分离组织分离：切取病组织,表面消毒,无菌水洗移人平板：1h;稀释分离：配孢子悬液,倒平板il培养7--10d分离菌移人斜面30min培养7--10d检查斜面上分离菌产孢30min 保存菌种2．病原细菌分离划线分离：倒平板沾菌悬液划线,1h;稀释分离3．病原真菌、细菌菌落培养性状观察平板上形成单菌落1--3d观察迦些写报告4．病原细菌菌苔培养性状观察斜面上形成菌苔i-3d观察30min写报告5．病原细菌液体培养性状观察接菌于液体培养基30min培养2--3d观察30min写报告六、实验作业l.上交分离的病原真菌、细菌菌种;2．写出病原真菌、细菌培养性状观察的实验报告;七、思考题1．如果要分离的病原真菌是鞭毛菌中的腐霉菌、疫霉菌等应当如何进行才会获得更好的效果2．在分离病原真菌时,向平板培养基中加人乳酸为什么会大大减少细菌的污染3．如果要从土壤中分离某种病原菌,应当采取什么样的分离方法会更有效4．观察记载真菌及细菌的培养性状有何意义5．怎样才能知道你获得的病原真菌、细菌的菌种是否是纯培养附1 常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离;从病斑部分切取每边3—5mm的小块组织,在70％酒精中浸数秒钟后,移人0．1％的升汞水溶液中处理3—5rain,以灭菌水冲洗3次,移置培养皿的培养基中,然后培养;2．维管束组织内病原菌的分离;从根茎维管束组织分离病菌,可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒,将表皮组织用灭菌的解剖刀削去,然后切取其中小块变色的维管束组织,用升汞或漂白粉液消毒后,用灭菌水冲洗几次,移置培养基面上;3．根腐病病原菌的分离;根腐或基腐病的分离,由材料的大小决定;材料小的可仿照斑点病的分离法,材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法;4．肉质组织中病原菌的分离;多肉的根、茎及果实等,可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织,切取小块病组织分离;如有杂菌感染可采用“直接接种”法,待出现症状后,用此法再行分离;5．种子内病原菌分离;将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒升汞或漂白粉,用灭菌水洗涤后,移置培养基上;6．孢子分离法;能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等,则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之;7．土壤带菌分离法;为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形,从有病的土壤中分离它们是必要的;分离方法是将土壤取出少许,配制成悬浮液,然后用稀释法或划线法分离;。

接种、分离纯化和培养技术一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

１、接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。

由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。

有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。

在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。

（图３－３）图３－３接种和分离工具1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。

即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。

常用的接种工具有接种环，接种针等。

在斜面接种和平板划线中就常用此法。

２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。

此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。

除三点外，也有一点或多点进行接种的。

３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。

做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。

用的培养基一般是半固体培养基。

它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。

４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。

待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。

５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。

６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。

７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。

细菌的分离与培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。

实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。

实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。

若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。

用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。

课时安排：2课时操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。

2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。

划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。

3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。

4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。

5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。

二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。

可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。

操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。

1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。

2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。

3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。

实验报告：细菌的分离培养与纯培养一、背景细菌是一类微生物，是生命中最简单的有细胞结构的生物。

它们广泛存在于自然界的各个环境中，包括水体、土壤、空气和人体等。

为了了解细菌的性质、研究其生物学特性以及开发应用价值，分离培养并得到纯培养的细菌菌株是必不可少的步骤。

本次实验旨在通过分离培养的方法，从样本中分离出单一种类的细菌，然后进行纯培养，最终得到该细菌的纯培养物。

二、实验方法和步骤1. 实验材料准备•细菌样本：采集自自然环境或已知细菌株。

•培养基：根据细菌的特性选择适当的培养基，如营养琼脂平板。

•培养基成分：包括葡萄糖、氯化钠、琼脂等。

•培养基容器：如琼脂平板、试管等。

•实验器材：消毒锅、试管架、涂布棒等。

•实验仪器：恒温培养箱、显微镜等。

2. 分离培养实验步骤步骤1：样品的采集和制备从自然环境中采集待研究的细菌样品，例如土壤、水样等。

将样品收集在无菌容器中，并在实验室内进行处理。

步骤2：样品的稀释取一定量的培养基，根据需要的适宜稀释倍数（一般为10-1~10-5），将样品和培养基按比例混合，制成一系列不同稀释度的样品溶液。

使用无菌滴管，分别取适量的样品溶液接种到对应的琼脂平板上。

步骤3：平板涂布使用消毒好的涂布棒，将样品溶液均匀涂抹在琼脂平板上，然后用标签标记每个平板。

涂布完毕后，将平板倒置放在无菌培养箱中，孵育一段时间。

步骤4：单菌落的分离观察培养箱中的平板，找出生长菌落较少、分散且各不相连的菌落。

使用无菌的细胞刮取棒在菌落边缘轻轻划线，然后用刮取棒将菌落刮移到另一块琼脂平板上。

此时，细菌已被成功分离。

3. 纯培养实验步骤步骤1：选取单菌落进行培养从分离得到的细菌菌落中挑选出一个单菌落，利用无菌的细胞刮取棒将其转移到新的琼脂平板中。

步骤2：液体培养将得到的单菌落转移到含有适宜培养基的液体培养基中，如含有营养成分和抗生素的葡萄糖盐水。

利用无菌的试管，接种适量的菌落，并在恒温培养箱中以适当条件培养。

实验四（五）环境中微生物分离与培养一、实验目的1、掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾堆肥等）中分离培养细菌的方法，获得若干种细菌纯种培养技能。

2、掌握几种接种技术。

3、了解菌种的保藏方法。

二、实验仪器和材料恒温箱、涂布器、细铁丝、接种环、酒精灯、吸耳球、棉花、记号笔；无菌培养皿（直径90毫米）、无菌移液管（1毫升和10毫升）；肉汤蛋白胨培养基、高氏１号培养基、马铃薯培养基；活性污泥或土壤10克、无菌水90毫升、9毫升无菌水（试管中）；酵母、大肠杆菌。

三、细菌纯种分离的操作方法细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。

（一）稀释平板分离的方法1、取样用无菌锥形瓶到现场取一定数量的活性污泥或土壤，迅速带回实验室。

2、稀释水样将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6依次编号。

在无菌操作条件下，将样品（10克）置于第一瓶90毫升无菌水中，用手摇10分钟，将颗粒状样品打散，即为10-1浓度的菌液。

用1毫升无菌移液管吸取1毫升10-1浓度的菌液于一管9毫微升无菌水中，同样方法，依次稀释到10-6。

每次稀释时，需用不同的无菌移液管，或将同一移液管用无菌水洗三次。

3、平板的制作取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个，另1个为空气对照。

取1支1毫升无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5毫升菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀），加热熔化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃恒温箱中培养48小时，然后观察结果。

取对照无菌培养皿，打开皿盖10分钟后盖上皿盖，倒置30℃恒温箱中培养48小时后，观察结果。

细菌分离培养的方法细菌分离培养是一种将混合菌群中的单一菌株分离出来的方法，广泛应用于微生物学领域。

它可以用于筛选天然产生的生物活性物质、研究菌株的基因组信息、以及了解不同位置和环境下菌群变化规律等。

本文将会介绍几种微生物学领域中常用的细菌分离培养方法。

1. 纯培养法纯培养法是一种将混合物中的单一菌株分离出来并进行纯化的方法。

该方法需要在无菌环境下操作，并且无菌操作的条件需要在培养过程中得到维持。

具体操作步骤是：1）将待分离的混合菌液定量传到无菌琼脂平板上，用平板法进行涂布。

2）在温度控制、湿度适宜的条件下在恒温箱中进行培养。

3）待出现典型的克隆扩散现象后，单独挑选出一株细菌，进一步进行鉴定和纯化。

纯培养法在微生物分离培养中应用广泛，但缺点是操作时间长，操作技术要求高，且部分微生物无法进行纯化。

2. 砖红色菌法砖红色菌法是一种利用菌落色素差异对微生物进行按色分类和分离的方法。

具体操作步骤是：3）待菌落颜色出现明显的不同后，通过菌落色素差异挑选出特定细菌。

砖红色菌法的优点是操作简单，操作时间短，但缺点是该方法只能将菌落色素差异大的细菌进行分离，色素差异小的细菌无法进行分离。

3. 抑制法抑制法是一种将目标菌株从混合菌中分离出来并持续生长的方法。

具体操作步骤是：3）通过抑制剂对目标微生物的特异性选择，将目标微生物从混合菌中分离出来，并进行纯化培养抑制法的优点是操作简单，效率高，但缺点是适合性较低，只能选择特定的细菌进行分离。

4. 染色法染色法是一种通过对目标菌落进行染色以及形态特征的观察来区分细菌种类的方法。

该方法广泛应用于快速区分和分离肠道致病菌和常规致病菌。

具体操作步骤是：2）将涂布后的菌落进行瓶装液制备后加入到体液中。

3）通过菌落形态、细胞的颜色和形态特征等方面进行区分和分离。

染色法的优点是操作简单，操作时间短，但缺点是仅适用于某些特定性的细菌株。

需要通过多种方法进行分离和鉴定。

5. 双层琼脂平板分层法1）将待分离的混合液加入到浸入双层琼脂平板基层的上层琼脂中。

细菌分离与鉴定方法1.纯培养纯培养是将混合细菌通过稀释法或不同稀释度悬浮液的涂布、扩散或稀释平板接种法接种在适宜的培养基上，使各菌种生长成独立的菌落。

这样可以得到洁净的菌液或洁净的菌落。

2.菌落形态观察经纯培养得到菌落后，可以观察菌落特征，如菌落形状、颜色、大小、边缘等。

这些特点有助于初步区分不同的菌种。

3.各种培养基的利用根据细菌对不同种类培养基的利用差异，可以采用不同种类培养基进行分离与鉴定。

例如，选择亲水性对细菌有选择性的培养基可以分离出产胆红素的细菌。

4.微生物常规方法利用常规的生理生化特性进行鉴定，包括氧需求情况（需氧、厌氧、需气氛）、产气性、产酸性、产胆红素等特征。

5.细胞形态与结构鉴定利用显微镜观察细菌的形态特征，包括形状、大小、聚集方式等。

染色方法，如革兰氏染色和抗酸染色，可以帮助确定细菌的细胞壁结构、染色性质、胞内结构等。

6.生化反应测试通过观察细菌在特定生化反应条件下产生的能量代谢产物，如产气、酸碱反应等，可以推测出细菌的代谢途径和能力。

常用的生化反应试剂盒，如API系统和VITEK系统，可以通过细菌的酶活性、营养利用和代谢产物等参数对细菌进行鉴定。

7.16SrRNA基因分析16SrRNA基因是细菌特有的核糖体RNA的组成部分，其序列具有高度保守性和广泛分布性。

通过对16SrRNA基因的测序和比对，可以确定细菌的亲缘关系和系统发育位置，进而确定细菌的名称和分类。

细菌分离与鉴定方法的选择取决于需求和目标。

对于一般的实验室课程或常规鉴定需要，常规的菌落形态观察、生理生化试验和染色方法可以满足要求。

而对于复杂的鉴定和分类，特别是对于新菌种或未知细菌的鉴定，16SrRNA基因分析是一种非常有力的方法。