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米根霉α-淀粉酶基因的克隆与表达

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有 淀粉 酶 家族 所特有 的 ４个 典 型的 高度 保 守 区域 。 以质 粒 载体 ｐ Ｔ ２ ａ（ － 为基 础 构 建相 关表 Ｅ 一８ ４ ）
达 载体 ， 实现 了两个 淀粉 酶在 Ｅ ｃｌ ｉ中的 功 能性 表 达 。 两个 淀粉 酶在 Ｅ ｃｌ Ｂ ２ ＤＥ ）ｃ ｄ ｎ ｏ ｏｉ Ｌ １（ ３ ｏ ｏ — Ｐｕ ｌｓ宿主 中的表 达 量相 对较 高， 分别 为 １ ３Ｕ／ ． ｍＬ和 ０ ５Ｕ／ ． ｍＩ。其 中一个 淀粉 酶经 Ｎｉ 亲和柱 纯 化后 ， 于进 行 （ 用 马铃 薯 ） 淀粉 水 解 实验 ， 产 物 中 葡萄 糖 质 量浓 度 约 为 １ ／ Ｉ， 芽糖 质 量 浓度 终 ０ｇ ｄ 麦
米 根 霉 一 粉 酶 基 因的 克隆 与表 达 淀
李 松 ， 王 正祥
（ 南 大 学 生 物 工 程 学 院 ，江 苏 无 锡 ２ ４ ２ ） 江 １ １ ２
摘 要 ：以博德 研 究公 布 的米根 霉基 因组 信 息 为基 础 设计 引物 ， 分别 从 两株 米根 霉 中克 隆得 到 大
收 稿 日期 ： ０ ００ — ９ ２ １ ９０
基 金 项 目 ： 家 ８ ３ 划 项 目 （ ０ ６ Ａ０ ０ ０ ） 国 ６ 计 ２ ０ Ａ ２２ ４ 。 作 者 简 介 ：李松 （ ９ ０ ） 男 ， 徽 陆 安 人 ， 酵 工 程 博 士 研 究 生 。Ｅ ｉ ｉ ｎ ８ １ ２ ＠ １ ６ Ｃ Ｎ。 １８ 一 ， 安 发 ｍａｌ ｓ ｇ ２ １ ３ ２ ． Ｏ ：ｌ ｏ ＊通 信 作 者 ：王 正 祥 （ ９ ４ ） 男 ， 苏 盐 城 人 ， 学 博 士 ， 授 ， 士 研 究 生 导 师 ， 要 从 事 分 子 微 生 物 学 与 生 物 １６ 一 ， 江 工 教 博 主
小 为 １３ ６ｂ ８ ｐ的 ａ淀 粉 酶 编 码 基 因 。通 过 比 对 分 析 发 现 该 淀 粉 酶 基 因 内部 不 含 内含 子 ， 条 基 因 一 两
的相似 度 为 ９ ． ４ ， 因编码 产物 相似 度 为 ９ ． ４ 。基 因编码 产物 属 于淀粉 酶 家族 １ ５ ５ 基 ７ ８ ３成 员 ， 具
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关键 词 ：米根 霉 ； 菌 ａ 淀粉 酶 ； 真 一 大肠 杆 菌 ； 因表 达 基
中 图 分 类 号 ： ８ Ｑ ７５ 文 献 标 识 码 ：Ａ
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第 ３ ０卷 第 ５期
２１ Ｏ １年 ９月
食 品 与 生 物 技 术 学 报ｏ ｅ ｈ ｌｇ ｏ ｎ ｌｏ ｏ ｃｅ ｃ ｎｄ Ｂｉ ｔ ｃ ｎｏ ｏ ｙ
Ｖｏ． ０ ＮＯ １３ ．５ Ｓｅ ｔ ２Ｏ１ ｐ ｌ
文 章 编 号 ：６３１ ８ （０ １ ０—７ ６０ １ ７ —６ ９ ２ １ ） ５ ０ １ － ７
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米根霉产糖化酶发酵条件的研究

米根霉产糖化酶发酵条件的研究

万方数据　万方数据　万方数据米根霉产糖化酶发酵条件的研究作者：王新惠， 刘达玉， WANG Xinhui， LIU Dayu作者单位：王新惠,WANG Xinhui(长江师范学院,生命科学与技术学院,重庆,408100)， 刘达玉,LIU Dayu(成都大学,食品加工四川省重点实验室,四川,成都,610106)刊名：中国酿造英文刊名：CHINA BREWING年，卷(期)：2009，(9)被引用次数：0次1.武金霞.张贺迎.张瑞英一种快速检测糖化酶活力的电泳活性染色方法[期刊论文]-中国酿造 2004(01)2.王新惠.李再新.刘达玉米根霉糖化酶酶促反应条件的研究[期刊论文]-食品科技 2008(05)1.期刊论文王新惠.李再新.刘达玉.马艳华.李建.WANG Xin-hui.LI Zai-xin.LIU Da-yu.MA Yan-hua.LI Jian米根霉糖化酶酶促反应条件的研究-食品科技2008,33(5)以米根霉(Rhizopus oryzae)为供试菌株采用DNS法测定糖化酶的酶活力,系统地研究由该菌株分泌的糖化酶的酶促反应条件,主要考察反应时间、不同底物、底物浓度、反应温度、底物pH及金属离子等因素对酶活力的影响.结果表明,该酶系具有较高的酶活力可达到90 U/mL.对碳链较长的底物表现出较强的酶活力,最适酶促温度50～55℃,最适pH5.0～5.5,Mg2+、Zn2+和Ca2+对该酶系有不同程度的激活作用,其中Mg2+激活效应最大,而Mn2+、Cu2+和Fe2+对该酶系有不同程度的抑制作用,其中Mn2+的抑制作用最大.2.学位论文方华绍兴黄酒麦曲中微生物的初步研究2006本文采用3种培养基分离麦曲中的微生物，共得到16株丝状真菌。

真菌总菌落数达2.7×106个/g曲，伞枝犁头霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、烟曲霉占了所有分离真菌的89％。

比较了超声波法，Yatalase酶法和氯化苄法提取麦曲中微生物总DNA的效果后，采用氯化苄法作为提取麦曲样品中微生物总DNA的方法。

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达


糖化。淀粉糊化后的自然 LV 为 !Z#， 液化过程是在高温下进 行的， 常用的高温! 糖化 4淀粉酶作用的最适 LV 为 #Z’ ) "Z#， 过程的最佳 LV !Z$ ) !Z#， 在上述过程中就要反复调节 LV， 调整不当还会产 LV 值的调整大大增加了化学试剂的消耗，
［$］ 。如果能研究出既耐高温、 又在偏酸性环 生大量的副产物
。
主要试剂和仪器： 各种限制性内切酶、 5! K^3 连接酶
及 3"4 K^3 聚合酶购自 59U9S9 公司， 所用化学试剂均为分 析纯。引 物 合 成 由 上 海 博 亚 公 司 完 成。 R7$!%% 扩 增 仪 （3LL6:0D 2:.G?G-08G） 。 "$% 表达载体的构建 根据 W0A29AX 中 ".5/ 基因的序列以及大肠杆菌和毕赤 酵母表达载体上的多克隆位点的特征， 设计合成了两对引 物： 。 R& 、 R$ 和 R* 、 R（表 &） !
巴斯德毕赤酵母表达系统近年来被广泛应用， 由于其含 有分泌信号， 可将重组蛋白分泌到胞外， 人们已成功表达了
［( ) B］ 多种外源蛋白 。本文主要报道的是本实验室得到的一
个高温! 在大肠杆菌及毕赤酵母中进 4淀粉酶基因的突变体， 行了表达， 并对其产生的高温! 4淀粉酶进行了相关酶学性质 的研究分析。
以质粒 1C/4!:"4DEF 为模板， 分别以 .& 、 .> 和 .; 、 .B 为 引物， 进行 ./0 扩增， .& 、 .> 扩增产物经过 !"# 0!、 $%& A! 双酶切连接至 1GH>>I， .; 、 .B 扩增产物经过 !"# 0!、 ’#( ! 双 酶切连接至 1.J/@K。 !%& 转化及转化子筛选 将重组质粒 1GH>>I:"4DEF、 1.J/@K:"4DEF 转化 ! L "#)* 在含氨卞青霉素的抗性 NG 平板上筛选转 MA8 "感受态细胞， 化子， 提取质粒并进行酶切鉴定。将转化子 （ MA8 O1GH>>I: " 点种在含 &P 可溶性淀粉的 NG 平板上， 观察是否出 "4DEF） 现透明的淀粉水解圈。 提取 1.J/@K:"4DEF 质粒， 经 $+) #酶切后， 回收大片段， 电击法转化毕赤酵母 =’&&8，涂布 0MG 平板， ;IQ 培养直至 转化子出现， 用牙签挑取转化子对应点种到 FF 和 FM 平板 上， 在 FM 平板上生长正常， 在 FF 平板上不生 ;IQ 培养 >5， 长或者生长不正常的转化子为阳性转化子 （ =’&&8O1.J/@K:
米曲霉今野菌株所产α_淀粉酶性质的研究

米曲霉今野菌株所产α_淀粉酶性质的研究

文章编号:1000-9973(2002)12-0020-03米曲霉今野菌株所产α—淀粉酶性质的研究吕嘉枥1,张大为,苟金霞,廖昌军,王美芳2(11陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西咸阳　712081;21西安市酿造公司)摘要:采用硫酸铵盐析,再透析提纯得到米曲霉今野菌株的α-淀粉酶;该酶能耐受50～65℃的高温,在65℃处理2小时后剩余酶活力为85%;采用正交实验得其在反应过程中所受因素影响大小为酶液浓度>底物浓度>pH值>温度,酶反应的最适pH为610,最适温度为60℃;以可溶性淀粉为底物时,该α-淀粉酶的K m值为518×10-1m ol/L;当NaCl浓度超过30%时,对酶活有明显的抑制作用,剩余酶活力只有15%。

当NaCl浓度在18%以下时,剩余酶活力在90%以上。

关键词:米曲霉今野菌株;α-淀粉酶;性质中图分类号:TS201125 文献标识码:AStudy of theα-Amyla se Character producedby Asp.oryzae JinY eLU Jia2li ZHANG Da2wei,G OU Jin2xia,LIAO Chang2jun,WANG Mei2fang (11C ollege of Life Science and Engineering,Shanxi University ofScience and T echnology,X ianyang712081,China;2.X i’an Brewing C om pany) Abstract:This paper studied the character ofα-Amylase produced by Asp.oryzae JinY e.The result shows the α-Amylase is stable to heat treatment,after2hours under65℃its activity still remain85%.T o test by vari2 ous facts can get which is the main effects to the enzyme.The result is[E]>[S]>pH>T,the optimun pH and tem perature for enzyme catalysis is6.0and60℃,resperctively.The K m is5.8×10-1m ol/L.When the reactant is amylum,the enzyme is stable to18%s odium chloride.K ey words:Asp.oryzae JinY e;α-amylase;character 酱油是人民日常生活中必不可少的调味品,酱油酿造主要靠米曲霉的作用。

淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达

淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达

淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌（amp+）中的表达一、相关背景淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。

1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。

1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。

淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶类的总称。

现在淀粉酶大致可分为四大类:第一类α-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。

第三类葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）,习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次水解α-1，4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。

第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键，切下整个侧枝。

还有淀粉α-1，6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。

除此之外，不同性质的α-淀粉酶还具有许多不同的用途。

耐热性α-淀粉酶，由于使用时温度提高，液化完全，用酶量少，操作比较容易，β-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。

在制醋工业中，常用β-淀粉酶代替部分麸曲节省成本，在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。

在医药工业上，β-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖，医学上常用该酶和α-淀粉酶一道作为消化剂使用。

二、目前研究情况1 .国内外研究机构由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，国内外很多课题组对它进行了研究。