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银耳多糖的制备及一般鉴定【实验目的】1．学习真菌多糖类的分离、纯化原理。
2．学习多糖类物质的一般鉴定方法。
3. 掌握真菌多糖类粗提取的具体步骤及相应原理。
【实验原理】银耳是我国传统的一种珍贵药用真菌，具有滋补强壮、扶正固本之功效。
银耳中含有的多糖类物质则具有明显提高机体免疫功能、抗炎症和抗放射等作用。
提取与纯化动植物中存在的多糖或微生物胞内多糖，因其细胞或组织外大多有脂质包围，要使多糖释放出来，第一步就是去除表面脂质, 常用醇或醚回流脱脂。
第二步将脱脂后的残渣以水为主体的溶液提取多糖，这样提取得到的多糖提取液含有许多杂质。
杂质主要是无机盐，低分子量的有机物质及高分子量的蛋白质、木质素等。
第三步则要除去这些杂质，对于无机盐及低分子量的有机物质可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法除去；对于大分子杂质可用酶消化(如蛋白酶．木质素酶) ，乙醇或丙酮等溶剂沉淀法或金属络合物法。
多糖提取液中除去蛋白质是一个很重要的步骤，常用方法有S e v a g e法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。
（1）S e v a g e法是除蛋白的经典方法，主要是利用蛋白质在氯仿中变性的特点，用氯仿:正丁醇=5:1或4:1的二元溶剂体系按1:5加入到多糖提取液中，混合物经剧烈振摇后离心，蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶物而分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。
（2）三氯乙酸法利用三氯乙酸，在低温下搅拌加入到多糖提取液中，直到溶液不再继续混浊为止离心弃沉淀，即可达到脱蛋白的目的。
存在于溶液中的三氯乙酸经中和后，通过透析或超滤等方法除去。
（3）酶解法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。
（4）三氟三氯乙烷法将三氯乙烷按1:1的比例加到多糖提取液中，在低温下搅拌约10min，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次即得，此法效率较高，但因其易挥发，不宜大量应用。
银耳多糖的制备与分析一、实验目的1、了解银耳多糖制备的基本原理。
2、掌握糖类物质提取的基本操作技术。
二、实验原理银耳是真菌的一种，是我国传统的珍贵药材之一，具有滋阴润肺、益胃生津等功效。
常用于治疗虚劳咳嗽、阴伤燥咳、虚热口渴等症。
银耳多糖是银耳的主要药效成分，银耳中含有的多糖类物质则具有明显提高机体免疫功能，抗炎症和抗放射等作用。
1、制备（提取）原理：银耳多糖易溶于水，但不溶于乙醇。
因此本实验采用沸水抽提、氯仿-正丁醇法除蛋白和乙醇沉淀分离制得银耳多糖粗品。
然后再进行定性分析。
2、分析（鉴定）原理：Molish反应多糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下，脱水形成糠醛及其衍生物，其与α-萘酚反应，作用生成紫色的化合物。
原理是羰基与酚类进行了缩合，这样，糖与浓酸作用后，再与α-萘酚反应，就能生成紫色的化合物。
因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有无糖的存在。
斐林试剂质量浓度为0.1g/mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05g/mL的硫酸铜溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的氢氧化铜沉淀。
氢氧化铜与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成砖红色的氧化亚铜沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。
用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化为：浅蓝色棕色砖红色（沉淀）。
三、实验试剂和器材1、银耳子实体2、乙醇3、乙醚4、丙酮5、Ssvag试剂：氯仿：正丁醇=6、Molish试剂：取5g α-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配置，棕色瓶保存。
7、斐林试剂：甲液质量浓度为0.1g/mL的氢氧化钠溶液乙液质量浓度为0.05g/mL的硫酸铜溶液临用时临时配置，将4～5滴乙液滴入2mL甲液中，配完后立即使用。
仪器和器材烧杯试管分液漏斗容量瓶电炉石棉网纱布离心机真空干燥箱电子天平四、实验步骤（一）制备步骤1、取银耳子实体10g加水300mL，直火提取1h，提取过程中不断用玻棒搅拌。
实验一银耳多糖的制备及分析实验目的：1. 学习真菌多糖类的分离、纯化原理。
2. 掌握多糖类物质的提取及一般鉴定方法。
实验原理：银耳（Tremella fuciformis）是我国一种传统的珍贵的真菌，具有滋补强壮、扶正固本之功效。
银耳中含有的多糖类物质则具有明显提高机体免疫功能、抗炎症和抗放射等作用。
多糖（polysaccharides）的纯化方法很多，但必须根据目的物质的性质及条件选择合适的纯化方法。
而且往往用一种方法不易得到理想的结果，因此必要时应考虑合用几种方法。
1、乙醇沉淀法：乙醇沉淀法是制备黏多糖的最常用手段。
乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。
供乙醇沉淀的多糖溶液，其含多糖的浓度以1%----2%为佳。
加完酒精，搅拌数小时，以保证多糖完全沉淀。
沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥即可得疏松粉末状产品。
2、分级沉淀法：不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的黏多糖。
3、季铵盐络合法：黏多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC）等能形成季铵盐络合物。
这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物可以解离，溶解，释放。
本实验采用银耳子实体，经沸水抽提、氯仿—正丁醇法除蛋白质和乙醇沉淀分离可制得银耳多糖粗品，再用CTAB（溴化十六烷基三甲铵）络合法进一步精制可得银耳多糖精品。
然后进行定性和定量测定及杂质含量测定。
实验器材：1、器材（1）布氏漏斗 1 只（2）500ml抽滤瓶 1 只（3）250ml分液漏斗 1 只（4）100ml量筒 2 只（5）10ml量筒 1 只(6) 离心机 1 只（7）烧杯 2 只（8）水浴锅 1 只2、试剂（1）银耳实体：10g（2）2%CTAB:取2gCTAB溶于100ml蒸馏水中，摇匀备用（3）2mol/L 氢氧化钠溶液，6.2mol/L氯化钠溶液（4）氯仿—正丁醇溶液（4：1）（5）95%乙醇（6）甲苯胺（7）乙醚（8）无水乙醇（9）浓硫酸（10）a—萘酚（11）斐林试剂：A液：将34.5g硫酸铜（Cuso4.5H2O）溶于500ml水中B液：将125g氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500ml水中，临用时，将A B两液等量混匀。
一、实验目的1. 学习银耳多糖的提取方法；2. 掌握银耳多糖的纯化技术；3. 分析银耳多糖的溶液性质。
二、实验原理银耳多糖是一种具有多种生物活性的大分子物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、抗凝血血栓、抗溃疡、促进蛋白质合成、抗病毒、促进神经细胞生长及改善记忆力等多方面的活性。
银耳多糖的提取主要是利用银耳中的多糖类物质，通过物理或化学方法将其从银耳中分离出来。
三、实验材料与仪器1. 材料：椴木银耳、2%的氢氧化钠、1%活性碳、5%的苯酚溶液、标准葡萄糖溶液、硫酸、乙醇、丙酮、乙醚、DEAE-C52、Sevage试剂、0.5mol·L-1盐酸、2mol·L-1 NaCl溶液。
2. 仪器：双重蒸馏水蒸馏器、超级恒温水浴、旋转蒸发仪RE52型、紫外可见分光光度计752N、低速大容量多管离心机LXJ-B型、透析袋、铝锅、搅拌器、天平、精密电子天平、电炉等。
四、实验方法1. 银耳多糖的提取（1）将椴木银耳洗净，浸泡于水中，使其充分吸水膨胀；（2）将膨胀后的银耳煮沸30分钟，以破坏细胞结构，释放出银耳多糖；（3）将煮沸后的银耳过滤，收集滤液；（4）向滤液中加入2%的氢氧化钠，调节pH值至7.0；（5）加入1%活性碳，搅拌30分钟，以去除杂质；（6）过滤，收集滤液；（7）向滤液中加入5%的苯酚溶液，以沉淀银耳多糖；（8）将沉淀物离心，收集沉淀物；（9）将沉淀物用乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂洗涤，去除杂质；（10）将洗涤后的沉淀物在60℃下烘干，得到银耳多糖。
2. 银耳多糖的纯化（1）将银耳多糖溶解于水中，配成一定浓度的溶液；（2）将溶液通过DEAE-C52层析柱，以去除杂质；（3）收集层析柱流出液，加入Sevage试剂，以去除杂质；（4）将流出液离心，收集沉淀物；（5）将沉淀物用乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂洗涤，去除杂质；（6）将洗涤后的沉淀物在60℃下烘干，得到纯化的银耳多糖。
实训银耳多糖制备及鉴定［任务描述］银耳是我国传统的一种珍贵药用真菌。
银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，不含核酸、蛋白质类物质。
银耳多糖具有明显提高机体免疫功能、抑制肿瘤转移、抗炎症、抗放射、抗血栓、降血糖等作用，是一种滋补强壮、扶正固本的保健食品和药物。
本次实训利用酶浸提法，银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，再用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）络合法进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定。
[任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集银耳多糖制备及鉴定工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备银耳子实体干品20g（2）试剂2mol/L的氢氧化钠溶液、2mol/L氯化钠溶液、2mol/L盐酸溶液、无水乙醇、95%乙醇、浓氨水、乙醚、浓硫酸、α-萘酚、0.5%甲苯胺乙醇溶液、5%三氯乙酸-正丁醇溶液、复合酶制剂（含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶）、活性炭、硅藻土、2%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、蒽酮、正丁醇、吡啶、冰醋酸、苯胺、邻苯二甲酸、葡萄糖标准品。
（3）仪器布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、量筒、DEAE-C薄板、离心机、水浴锅、透析袋、滤纸、薄层展开缸、组织捣碎机、分光光度计、不锈钢锅。
二、操作过程（一）操作流程见图1。
（二）操作过程1.银耳预处理选无杂质银耳子实体干品20g放入不锈钢锅中，加水1600mL，于20℃～25℃浸泡30min，置高速组织捣碎机中充分捣碎，制成银耳浆液。
2.酶浸提将银耳浆液用2mol/L盐酸溶液调pH至6.3，加入1%复合酶制剂，50℃下酶促反应40min，迅速升温至80℃灭酶，并保温浸提约1.5h，浸提液于80℃水浴浓缩至糖浆状。
银耳多糖纯化的检测分析摘要：银耳中含有丰富的银耳多糖（约占银耳干重的60％～70％)。
本实验的主要内容是银耳多糖纯化的检测分析，首先对银耳采用水煮法按料水比1：40(m／v)在100℃水中浸提8h提取银耳多糖。
得到的提取液用硅藻土助虑，然后用1%、0.5%、1.5%的活性炭吸附脱色，最后用透析袋透析48h，透析液经离心、洗涤、真空干燥得到银耳多糖粗品。
经测得银耳多糖粗品的含糖量为31.3%。
关键词:银耳多糖；纯化；活性炭；透析1 前言银耳为真菌类，别名白木耳、雪耳、银耳子等【1】。
银耳所含化学成份比较复杂．主要可分为3大类，即多糖类、脂类和蛋白类(酶、蛋白质、氨基酸)，此外有无机盐、维生素B 族等。
灰分中含S、P、Fe、Mg、Ca、K、Na等成分。
银耳多糖是从银耳子实体或液体深层发酵的银耳孢子中提取出来的一种活性多糖，银耳多糖是银耳的主要有效成分(约占银耳干质量的60％～70％)，据国内外学者研究报道，银耳多糖作为银耳的主要活性成份可分为酸性杂多糖、中性杂多糖(多糖LPS)、酸性低聚糖、胞壁多糖和胞外多糖5大类。
Ukai等(1972)从银耳子实体中分离出3种酸性杂多糖A、B、C。
这3种多糖主要是由木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖组成．还有少量葡萄糖及微量岩藻糖，其分子中有典型的乙酰基结构。
Tsubaki等(1977)从银耳的培养液中分离到一种具有高分子量和高分支的酸性杂多糖，主要由D一甘露糖、D一木糖、岩藻糖、D一葡糖醛酸和D一乙酰基构成。
Sone等(1978)从银耳细胞壁中分离到2种胞壁多糖，胞壁外层产生的酸性多糖是由D一葡萄糖醛酸、D一甘露糖和D一木糖组成的．胞壁中的碱不溶多糖由D一葡萄糖、D一葡萄糖醛酸、D一甘露糖和D一木糖组成。
Kakuta等(1979)从银耳细胞深层发酵孢子体中分离到主链结构与子实体多糖相似的酸性杂多糖，仅在支链上稍有些区别：其主链结构都是由糖苷键连接的甘露聚糖，在主链的2，4，6位上连接有葡萄糖、葡萄糖醛酸和木糖等组成的侧链，表明深层培养的银耳孢外多糖和子实体提取的银耳多糖在组分上无明显的区别。
银耳中银耳多糖的测定方法1 范围本文件描述了采用离子色谱法对银耳中银耳多糖的定性定量方法。
本文件适用于银耳中银耳多糖经酸水解后的特征性单糖——岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的测定。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验方法GB/T 35945新型生物发酵名词术语3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.1银耳多糖 tremella fuciformis extract由担子菌银耳中提取的一类多糖。
[来源：GB/T 35945-2018，2.1.8.8]4 原理银耳多糖样品在酸性条件下水解成单糖，其中特征性单糖——岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，采用阴离子交换柱分离，脉冲安培检测器测定，保留时间定性，峰面积外标法定量。
5 试剂和溶液除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。
5.1 标准品5.1.1 岩藻糖标准品（CAS号：2438-80-4）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.2.1 氮气（ 5.1.2半乳糖标准品（CAS 号：59-23-4）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.1.3 葡萄糖标准品（CAS 号：492-62-6）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.1.4木糖标准品（，CAS 号：58-86-6）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.1.5 甘露糖标准品（，CAS 号：31103-86-3）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.2试剂N 2），99.99%。
5.2.2 甲醇（CH 3OH ），色谱纯。
5.2.3 三氟乙酸（C ₂HF ₃O ₂），分析纯。
