纤溶系统之组织型纤溶酶原活化剂t-PA介绍

血浆纤溶酶原激活物抑制剂—1、组织型纤溶酶激活物在胃癌侵袭与转移中的作用目的：对血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）与组织型纤溶酶激活物（t-PA）在胃癌侵袭与转移中的作用进行研究。

方法：选取28例胃癌患者设为病例组，另选取同期25例健康体检者设为对照组，采用酶联免疫吸附法检测上述检测者血浆标本PAI-1和t-PA含量。

结果：病例组血浆PAI-1含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.005）；t-PA含量高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。

胃癌患者血浆PAI-1含量在Ⅲ期明显高于Ⅳ期，差异有统计学意义（P＜0.05）；而血浆t-PA含量与胃癌TNM分期无关。

血浆PAI-1含量在有淋巴结转移患者中最高，无淋巴结转移患者中次之，在正常对照组中最低，三者之间差异有统计学意义（P＜0.05），说明血浆PAI-1含量与胃癌淋巴结转移相关，并随着淋巴结转移的产生而增高。

血浆t-PA含量在三者之间比较差异无统计学意义（P>0.05），说明血浆t-PA含量与胃癌淋巴结转移无关。

结论：PAI-1在胃癌的侵袭和转移中起重要的促进作用，PAI-1可以成为胃癌诊断和预后估计的指标。

标签：胃癌；纤溶酶原激活物抑制剂-1；组织型纤溶酶激活物胃癌是世界上最高发病肿瘤之一，胃癌转移是肿瘤最重要的恶性特征，也是导致肿瘤患者死亡的最主要原因[1]。

目前相关研究认为恶性肿瘤侵袭转移与纤溶活力密切相关[2]。

纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）是纤溶酶原活化系统的特异、快速的抑制物，具有多种生物学功能，参与细胞的迁移、黏附及侵袭过程，组织型纤溶酶原激活物（t-PA）是来源于血管内皮细胞的纤溶系统的主要激活剂。

国内研究表明，PAI-1浓度与结肠癌[3]、子宫内膜癌[4]、肺癌[5]密切相关。

本研究检测胃癌患者血浆PAI-1和t-PA含量，分析以上各项指标与胃癌侵袭、转移的关系，为临床判断预后、指导治疗提供依据，现报道如下。

纤溶亢进血液凝固过程中形成的纤维蛋白被分解液化的过程，叫纤维蛋白溶解[现象] fibrinolysis（简称纤溶）。

纤溶活性异常增强,即称为纤溶亢进。

纤溶亢进又分为原发性和继发性两类。

1概念原发性纤溶亢进：是由于纤溶酶原激活剂(t-PA、u-PA)增多导致纤溶酶活性增强，后者降解血浆中纤维蛋白原和多种凝血因子，使它们的血浆水平和活性下降。

临床表现常见于t-PA、u-PA增多的疾病。

原发性纤溶亢进症时，纤维蛋白原在没有大量转化成纤维蛋白之前即被降解，D-二聚体为阴性或不升高。

继发性纤溶亢进症，如血栓性疾病、DIC等，由于疾病前期凝血机制增强，纤维蛋白大量生成，继而引起纤溶亢进，因此D—二聚体阳性或显著升高。

血浆D-二聚体这是纤维蛋白降解后的特异性产物，测定血浆D-二聚体可以判断纤维蛋白是否已经生成，从而为鉴别原发性和继发性纤溶亢进症提供重要依据。

定性试验：阴性定量试验：<400μg/L。

纤溶的激活物（纤溶酶原和纤维蛋白溶解酶即纤溶酶）和抑制物以及纤溶的一系列酶促反应，总称为纤溶系统。

血浆中抑制纤维蛋白溶解的物质统称为纤溶抑制物。

它们存在于血浆、组织及各种体液中。

根据其作用可分为两类：一类是抑制纤溶酶原激活，称为抗活化素；另一类是抑制纤溶酶的作用，称为抗纤溶酶。

目前，临床上已广泛应用的止血药，如凝血酸、止血芳酸和6-氨基己酸等，就是抑制纤溶酶生成及其作用的药物。

在正常情况下，血液中的抗纤溶酶的含量高于纤溶酶的含量，因而纤溶酶的作用不易发挥。

但在血管受损发生血凝块或血栓后，由于纤维蛋白能吸附纤溶酶原和激活物而不吸附抑制物，因而纤溶酶大量形成和发挥作用，使血凝块或血栓发生溶解液化。

2纤溶系统组成及特性（1）组织型纤溶酶原激活物（t-PA）：t-PA是一种丝氨酸蛋白酶，由血管内皮细胞合成。

t-PA激活纤溶酶原，此过程主要在纤维蛋白上进行。

（2）尿激酶型纤溶酶原激活物（U-PA）：u-PA由肾小管上皮细胞和血管内皮细胞产生。

1引言（或绪论）组织型纤溶酶原激活剂(Tissue Type Plasminogen Activator, t-PA)激活纤溶酶原形成纤溶酶，是体内纤溶系统的生理性激动剂，在人体纤溶和凝血的平衡调节中发挥着关键性的作用，是一种新型的血栓溶解剂。

t-PA在组织和体液中含量甚微，分子量很大，从天然组织提取或人工合成药用t-PA均有很大难度。

本实验运用基因工程手法，从人胎盘染色体基因库中筛选出TPA基因，将其雨质粒结合，导入到人黑色素瘤细胞当中，组建能够表达t-PA基因的工程细胞。

然后将人黑色素瘤细胞无血清连续培养，并运用高效诱导剂，从而快速、大量地获得了含组织型纤溶酶原激活剂(tPA)水平较高的培液。

经免疫亲和层析、Sephadex G-150凝胶过滤，培液中t-PA得以快速有效地纯化。

将纯化后的tPA与WHO标tPA抗体作免疫鉴定。

2组织型纤溶酶原激活剂简述2.1组织型纤溶酶原激活剂原激活剂(PA)是以丝氨酸为活性中心的蛋白酶。

它能将纤溶酶原转化为纤溶酶，在纤溶系统中有重要作用。

同时，PA与细胞转移、血液凝固、组织重建、激欣产生及原发性肿瘤的发生等生理和病理生理现象有密切的关系。

人纤溶酶原激活荆有尿激酶型（uPA）及组织型(tPA)两种主要类型。

这两种蛋白质免疫性不同，分子量有区别，由不同的基因编码。

tPA主要是由血管内皮细胞合成的单链多肽，分子量约为68000，在纤溶酶或胰蛋白酶作用下，水解Arg275-Ilu276肽键，形成由二硫键连接的双链结构。

氨基末端在重链，羧基末端在轻链。

重链有两个三角区结构，并有与纤维结合素指形结构有同源性的区域和生长因子样区域等。

轻链含有由His(322)}、Asp（371）、Ser （478）组成的酶活性中心。

tPA对纤维蛋白原亲和力很低，对纤维蛋白亲和力极高,. tPA-纤维蛋白复合物能高效且特异地激活血凝块中的纤溶酶原，形成纤溶酶，后者溶解血栓中的纤维蛋白，但几乎不激活循环血液中的纤溶系统，因此，tPA是一种较为理想的血栓溶剂。

我国重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）在肺血栓栓塞（PTE）中的应用进展摘要：本文对我国溶栓药物重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）在肺血栓栓塞（PTE）中的动物实验及临床应用进行综述，表明rt-PA在PTE治疗中具有重要作用及阐述我国对rt-PA的研究状态。

关键词：肺血栓栓塞症；重组组织型纤溶酶原激活剂肺血栓栓塞症（pulmonary thromboembolism，PTE）是指来自全身静脉系统或右心的内源性或外源性栓子阻塞肺动脉或其分支，引起肺循环和呼吸功能障碍的临床和病理生理综合征，占肺栓塞的绝大多数，是最常见的肺栓塞类型，通常所称的肺栓塞（PE）即指PTE。

①目前将PTE和DVT（深静脉血栓）统称为静脉血栓栓塞症（VTE）。

对于肺栓塞的流行病学资料至今仍然缺乏，根据Heit JA、Cohen AT、Anderson FA等的研究表明，全球每年确诊的肺血栓栓塞症和深静脉血栓形成人数约数百万人。

美国致死性和非致死症状性静脉血栓栓塞症发生例数每年超过90万，其中约29.64万例死亡，其余非致死性静脉血栓栓塞症包括37.64万例深静脉血栓形成和23.71万例肺血栓栓塞症；在致死性病例中，约60%的患者被漏诊，只有7%的患者得到及时与正确的诊断和治疗。

②我国目前缺乏肺栓塞准确的流行病学调查资料，但随着临床医师诊断意识的不断提高，肺动脉造影等诊断手段的提升，目前肺栓塞的诊断及治疗得到长足的发展。

目前肺栓塞已成为一种公认的常见血管疾病。

国外对重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）在肺血栓栓塞（PTE）中的应用相关研究及报道已经比较成熟：2003年Le Conte P、Huchet L等人公布了rt-PA治疗急性肺栓塞合并休克的临床研究，该结果证实rt-PA溶栓治疗血流动力学不稳定的急性大块肺栓塞可将死亡58.3%降至23.8%，且仅有少数发生轻微出血并发症。

③1992年Dalla-Volta S、Palla A等人开展一项rt-PA溶栓治疗与肝素抗凝治疗急性肺栓塞的比较研究，结果显示与常规肝素抗凝治疗相比，使用rt-PA溶栓能够明显改善肺栓塞患者的血流动力学和肺动脉造影结果，但是会导致出血时间延长及渗血状况。

t-PA简介目录•1检查名称•2分类•3tPA的别名•4概述•5原理•6试剂o 6.1活性测定（tPA∶A，发色底物法之一）：o 6.2活性测定（tPA∶A发色底物法之二）：o 6.3抗原测定（tPA∶Ag）ELISA法：•7操作方法•8正常值•9临床意义•10附注这是一个重定向条目，共享了组织纤维溶酶原激活物的内容。

为方便阅读，下文中的组织纤维溶酶原激活物已经自动替换为tPA，可点此恢复原貌，或使用备注方式展现1检查名称tPA2分类临床血液检查/出血和凝血检查3tPA的别名组织纤维溶酶原激活物4概述组织纤溶酶原激活物是一种单链糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成、分泌，不断释放入血液，广泛存在于机体的各种组织内，肝脏是组织纤溶酶原激活物灭活的主要场所。

它对纤维蛋白有高度亲和力，然后将酪氨酸纤溶酶原形成纤溶酶。

降解纤维蛋白（原）和部分凝血因子。

是纤溶系统的关键物质。

5原理（1）活性测定（组织纤维溶酶原激活物∶A，发色底物法之一）：血浆优球蛋白部分含有包括组织纤维溶酶原激活物以及全部凝血因子，但不含PA抑制物。

加入过量的纤溶酶原与纤维蛋白的共价物，样品中之组织纤维溶酶原激活物易吸附于纤维蛋白，并将血纤溶酶原转变成纤溶酶，后者使发色底物显色。

血浆tP组织纤维溶酶原激活物与显色的深浅呈正相关。

（2）活性测定（组织纤维溶酶原激活物∶A发色底物法之二）：在组织纤维溶酶原激活物和加速剂作用下，纤溶酶原转变为纤溶酶，后者使发色底物S2390释放出发色基团PNA。

PNA显色的深浅与纤溶酶和组织纤维溶酶原激活物呈正比关系。

（3）抗原测定（组织纤维溶酶原激活物∶Ag）ELISA法：本试验根据双抗体夹心法原理，即将纯化的组织纤维溶酶原激活物单克隆抗体包被在固相载体上温育，然后加含有抗原的待测标本。

标本中的组织纤维溶酶原激活物抗原与固相载体上的抗体形成复合物。

此复合物与过氧化物酶标记的组织纤维溶酶原激活物单克隆抗体起抗原抗体结合反应，形成组织纤维溶酶原激活物POD复合物。

Human t-PAFOR RESEARCH USE ONLYAssay range：0.2µg/L-8µg/L96determinationsPurposeThis kit allows for the determination of t-PA concentrations in Human serum,cell culture supernates and other biological fluidsPrinciple of the assayT he kit assay Human t-PA level in the sample，use Purified Human t-PA antibody to coat microtiter plate wells,make solid-phase antibody,then add t-PA to wells,Combined t-PA antibody which With HRP labeled,become antibody-antigen-enzyme-antibody complex,after washing Completely,Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed,reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of450nm.The concentration of Human t-PA in the samples is then determined by comparing the O.D.of the samples to the standard curve.Materials provided with the kit1wash solution20ml×1bottle7Stopp Solution6ml×1bottle 2HRP-Conjugate reagent6ml×1bottle8Standard（16µg/L）0.5ml×1bottle 3Microelisa stripplate12well×8strips9Standard diluent 1.5ml×1bottle 4Sample diluent6ml×1bottle10Instruction15Chromogen Solution A6ml×1bottle11Closure plate membrane26Chromogen Solution B6ml×1bottle12Sealed bags1 Specimen requirements1.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevantliterature,and should be experiment as soon as possible after the extraction.If it can’t, specimen can be kept in-20℃to preserve,Avoid repeated freeze-thaw cycles.2.Can’t detect the sample which contain NaN3,because NaN3inhibits HRP active.Assay procedure1.Dilute and add sample:Dilute Original density Standard as follow table:8µg/L5Standard150µl Original density Standard+150µl Standard diluent4µg/L4Standard150µl5Standard+150µl Standard diluent2µg/L3Standard150µl4Standard+150µl Standard diluent1µg/L2Standard150µl3Standard+150µl Standard diluent0.5µg/L1Standard150µl2Standard+150µl Standard diluent2.add sample：Set blank wells separately(blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent,other each step operation is same).testing sample well.add standard50µl in the Microelisa stripplate accurately,add Sample dilution40µl to testing sample well,then add testing sample10µl(sample final dilution is5-fold),add sample to wells,don’t touch the well wall as far as possible,and Gently mix.3.Incubate:After closing plate with Closure plate membrane,incubate for30min at37℃.4.Configurate liquid:30-fold(or20-fold)wash solution diluted30-fold(or20-fold)with distilled water and reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane,discard Liquid,dry by swing,add washing buffer to every well,still for30s then drain,repeat5times,dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent50µl to each well,except blank well.7.incubate：Operation with3.8.washing：Operation with5.9.color：Add Chromogen Solution A50ul and Chromogen Solution B to each well,evade the light preservation for15min at37℃10.Stop the reaction：Add Stop Solution50µl to each well,Stop the reaction(the blue colorchange to yellow color).11.assay：take blank well as zero,Read absorbance at450nm after Adding Stop Solution andwithin15min.Steps descriptionStandard,Sample diluentcalculateCalculateTake the standard density as the horizontal,the OD value for the vertical,draw the standard curve on graph paper,Find out the corresponding density according to the sample OD value by the Sample curve,multiplied by the dilution multiple,or calculate the straight lineregression equation of the standard curve with the standard density and the OD value,with the sample OD value in the equation,calculate the sample density,multiplied by the dilution factor, the result is the sample actual density.Important notes1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced15-30minutes inthe room temperature,ELISA plates coated if has not use up after opened,the plate should be stored in Sealed bag.2.washing buffer will Crystallization separation,it can be heated the water helps dissolvewhen dilute.Washing does not affect the result.3.add Sample with sampler Each step,And proofread its accuracy frequently,avoids theexperimental error.add sample within5min,if the number of sample is much,recommend to use Volley.4.if the testing material content is excessively higher(The sample OD is bigger than the firststandard well),please dilute Sample(n-fold),Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.5.Closure plate membrane only limits the disposable use,to avoid cross-contamination.6.The substrate evade the light preservation.7.Please according to use instruction strictly,The test result determination must take themicrotiter plate reader as a standard.8.All samples,washing buffer and each kind of reject should according to infective materialprocess.9.Do not mix reagents with those from other lots.Storage and validity1．Storage：2-8℃.2．validity：six months。