jc-1线粒体膜电位染色实验原理

JC-1线粒体膜电位检测试剂盒产品组成：产品编号BB-4105-1 BB-4105-2 BB-4105-3规格20 assays 50 assays 100 assaysJC-1 100ul 250ul 500ul10×孵育缓冲液4ml 10ml 20ml产品简介：线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。

可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。

在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，488nm激发时的最大发射波长为590nm，可以产生红色荧光，在流式图上表现为FL1和FL2双阳性；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，488nm激发时最大发射波长为527nm，可以产生绿色荧光，形成流式图中所有细胞FL1均为阳性。

凋亡细胞则大多为FL1单阳性。

这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。

常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

贝博线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，可以用于早期的细胞凋亡检测。

试剂盒染料与其他的阳离子染料如DiOC6(3)和罗丹明123相比，特异性更高，对线粒体膜电位变化的特异性高于质膜电位变化，对线粒体去极化检测的检测一致性更好；红绿色荧光强度比率只受线粒体膜电位的变化，不受线粒体大小，形状，密度的差异干扰；检测灵敏度强，对细胞应激反应的微小异质性都能辨别；使用方法：悬浮细胞1、孵育缓冲液和JC-1染色工作液的配制：根据样品数按下列比例配制孵育缓冲液和JC-1染色工作液。

取100ul 10×孵育缓冲液加900ul无菌纯水稀释，混匀并预热至37℃，即成1×孵育缓冲液；在500ul 1×孵育缓冲液中加入5ul JC-1，涡旋混匀配成JC-1染色工作液；2、收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。

线粒体膜电位检测（JC-1)大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关，其中线粒体跨膜电位（△ψ的破坏，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)是一种阳离子脂质荧光染料，可作为检测线粒体跨膜电位指示剂。

JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存在，高浓度时以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同，但均可在流式细胞仪绿色（FL-1）通道检测出绿色荧光，JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光；可被流式细胞仪的红色（FL-2）通道检测到，而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。

根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。

所需仪器或者试剂流式细胞仪或荧光显微镜、高速离心机、CO2培养箱、微量移液器1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、灭菌去离子水使用注意事项1．微量试剂取用前请离心集液。

2． JC-1避光保存及使用。

3．细胞培养的数量不宜超过1×106，否则细胞会产生自然凋亡影响检测。

4．对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗涤，或延长观测时间5．流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响，因诱导剂、细胞株类型，作用时间的不同而荧光强度比例都有不同，因此没有通用标准的补偿设门指南，因此每个试验需设阴性及阳性对照组进行荧光补偿及设门。

线粒体膜电位变化检测细胞凋亡实验原理JC-1（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide）是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。

可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。

在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光（FL-2 通道）；在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1 为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（FL-1 通道）。

这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。

常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。

通过JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

JC-1 单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。

实验用品1.12⨯75mm 的Falcon 管和15ml 聚苯乙烯离心管2.微量加样器和加样头3.线粒体检测试剂盒（货号551302，100tests），包括JC-1和10 ⨯ Assay Buffer, 注：每个KIT 包括 4 小瓶JC-1 试剂，每小瓶试剂足够检测25 个样本4.离心机5.CO2 培养箱6.流式细胞仪样本制备图1：试剂准备和JC-1 染色步骤总揽1.在JC-1粉末中加入125ulDMSO使其充分溶解，配成JC-1 Stock Solution，需根据实验的量分装-20度保存。

2.根据样本量配制JC-1 Working Solution，每个样品500ul 1×Assay Buffer + 5ulJC-1 Stock Solution。

jc1线粒体膜电位流式摘要：I.引言A.介绍JC1荧光探针B.阐述JC1与线粒体膜电位的关系II.JC1在细胞内的分布与线粒体膜电位A.线粒体膜电位的定义B.JC1在不同线粒体膜电位下的分布C.JC1荧光信号与线粒体膜电位的关系III.流式细胞术检测JC1荧光信号A.流式细胞术的原理B.流式细胞术在JC1检测中的应用C.流式细胞术检测JC1荧光信号的结果分析IV.JC1在生物医学研究中的应用A.JC1在细胞凋亡研究中的应用B.JC1在神经科学研究中的应用C.JC1在其他生物医学研究中的应用V.总结正文：I.引言JC1是一种荧光探针，可以用于检测线粒体膜电位。

线粒体是细胞内的能量工厂，参与细胞的生长、发育和凋亡等过程。

线粒体膜电位是反映线粒体功能的重要指标。

JC1与线粒体膜电位之间存在一定的相关性。

当线粒体膜电位低于-100mV时，JC1主要分布在细胞质中，呈现绿色荧光。

当线粒体膜电位高于-100mV时，JC1开始聚集在线粒体上，呈现红色荧光。

因此，通过流式细胞术检测JC1的荧光信号，可以间接反映线粒体膜电位的变化。

II.JC1在细胞内的分布与线粒体膜电位A.线粒体膜电位的定义线粒体膜电位是指线粒体膜内外两侧存在的电位差。

线粒体膜电位在细胞的能量代谢、信号转导等方面起着重要作用。

B.JC1在不同线粒体膜电位下的分布当线粒体膜电位低于-100mV时，JC1主要分布在细胞质中，呈现绿色荧光。

当线粒体膜电位高于-100mV时，JC1开始聚集在线粒体上，呈现红色荧光。

C.JC1荧光信号与线粒体膜电位的关系JC1的荧光信号与线粒体膜电位呈负相关。

当线粒体膜电位较低时，JC1的绿色荧光信号较强；当线粒体膜电位较高时，JC1的红色荧光信号较强。

III.流式细胞术检测JC1荧光信号A.流式细胞术的原理流式细胞术是一种通过激光束对细胞进行快速、准确计数和分选的技术。

流式细胞术可以对细胞进行多参数检测，包括荧光信号检测。

jc-1共聚焦步骤
JC-1是一种荧光染料,常用于测定细胞线粒体膜电位。

其共聚焦显微镜观测步骤如下：
1. 将待测细胞接种在共聚焦培养皿中,使其附着并生长至适当的数量。

2. 用PBS缓冲液洗涤细胞1~2次,以去除培养液和细胞碎片等。

3. 将含1µM JC-1的PBS加入共聚焦培养皿中,孵育30分钟至1小时,使JC-1染料进入细胞,并形成线粒体膜电位相关的荧光染色体。

4. 用PBS缓冲液洗涤细胞1~2次,尽可能地去除未结合的JC-1染料。

5. 将培养皿放入共聚焦显微镜中,使用荧光激发光源激发JC-1的红色和绿色荧光。

6. 通过软件调节激发波长和滤镜,使观察到的荧光信号最佳。

7. 通过共聚焦显微镜观察线粒体膜电位的变化。

通常,高线粒体膜电位的细胞会表现出更多的红色荧光,而低线粒体膜电位的细胞会表现出更多的绿色荧光。

JC-1单染法检测CCCP对内皮细胞线粒体膜电位的影响官福新;周露露;张宸豪;李妍【摘要】目的：分析碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）对人脐静脉内皮细胞ECV304线粒体的影响。

方法体外培养ECV304细胞，不同浓度CCCP处理细胞20 min 后，装载荧光探针JC-1或Rh123，流式细胞术检测JC-1单体的发射绿色荧光。

结果伴随线粒体毒性剂CCCP浓度增加，代表JC-1单体含量的绿色荧光强度增加。

结论流式细胞术检测JC-1单体的绿色荧光可反应线粒体膜电位的变化。

%Objective Analyze the influence of carbonyl cyano-to-chlorobenzene hydrazone ( CCCP ) on human um-bilical vein endothelial cells ECV-304 mitochondria .Methods ECV-304 cell was cultured in vitro and treated with different concentrations of CCCP for 20 minutes .After straining by fluorescent probes Rh 123 or JC-1 ,cells were meas-ured by flow cytometry .Results The intensity of green fluorescence emitted by JC-1 monomer increased with the in-creasing of CCCPconcentration .Conclusion The changing of cell MMP could be well detected by flow cytometry staining by new fluorescent probe JC-1 .【期刊名称】《吉林医药学院学报》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】3页(P324-326)【关键词】线粒体膜电位;碳酰氰基-对-氯苯腙;流式细胞术【作者】官福新;周露露;张宸豪;李妍【作者单位】吉林医药学院药学院2012级药学本班，吉林吉林 132013;吉林医药学院药学院2010级药学本班，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院，吉林吉林 132013【正文语种】中文【中图分类】R363线粒体是细胞内能量代谢的重要细胞器，是决定生存的控制中心。

线粒体膜电位测定方法线粒体膜电位测定方法是一种用于研究线粒体膜电位的定量方法,能够确定线粒体膜内外离子浓度的差异,进而推断线粒体代谢活动的状态。

下面将介绍线粒体膜电位测定方法的基本原理和步骤,并对其进行拓展。

一、线粒体膜电位测定的基本原理线粒体是一种细胞质颗粒,在细胞内起着至关重要的作用,它是细胞呼吸过程中的关键环节。

线粒体膜的主要功能是屏障,可以限制溶液中的离子进入线粒体内部,同时也允许离子从线粒体膜外进入。

当线粒体膜内外的离子浓度存在差异时,就会影响线粒体膜的电性质,导致线粒体膜发生电位变化。

线粒体膜电位的变化可以通过测量膜内外的电势差来实现。

具体来说,可以使用电极技术来测定线粒体膜内外的电势差。

常用的电极包括pH电极和na+-K+-ATP酶电极。

pH电极可以测量线粒体膜外的pH值,而na+-K+-ATP酶电极则可以测量线粒体膜外K+离子的浓度,从而推断线粒体膜外的离子浓度。

二、线粒体膜电位测定的步骤线粒体膜电位测定通常包括以下几个步骤:1. 准备电极材料和测量液。

通常需要使用pH电极和na+-K+-ATP酶电极,并准备相应的测量液。

其中,pH电极的pH值范围为7.4-8.4,na+-K+-ATP酶电极的na+离子浓度范围为35-65mM,测量液的pH值和na+离子浓度也需符合上述范围。

2. 将电极材料和测量液放入仪器中。

然后,将仪器连接到电脑或传感器上,并启动仪器,进行测量。

3. 记录测量结果。

根据电极的pH值和na+-K+-ATP酶电极的电动势差,可以计算出线粒体膜电位的变化值。

拓展:线粒体膜电位测定方法不仅可以用于研究线粒体膜电位的变化,还可以用于确定线粒体代谢活动的状态。

例如,当线粒体膜内外的离子浓度差异较大时,可能会导致线粒体代谢活性的变化,从而影响细胞的生长和死亡。

因此,通过线粒体膜电位测定方法可以确定线粒体膜内外离子浓度的差异,进而推断线粒体代谢活动的状态。

仅供科研版本号：161213 线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)【产品组成】【保存条件】-20℃,避光,12个月【产品概述】JC-1是一种检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) 的理想荧光探针。

在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1丌能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。

这样就可以通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化，常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。

通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，这种转变也可作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

JC-1单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm。

JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。

实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的装置即可。

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一种以JC-1为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测，CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

该试剂盒仅用于科研领域，丌宜用于临床诊断或其他用途。

【使用方法】1、配制JC-1染色工作液：取适量JC-1 Stain (200×)，按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀释JC-1，剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。

然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×)，混匀后即为JC-1染色工作液。

6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每0.5～1.0×106细胞需0.5ml JC-1染色工作液。

JC-1产品编号产品名称包装C2005 JC-1 1mg 产品简介：JC-1也称CBIC2(3)或5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide，分子式为C25H27Cl4IN4，分子量为652.23，CAS Number 3520-43-2，纯度>95%。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)∆Ψm的理想荧光探针。

可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。

在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。

这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。

常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。

通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

JC-1单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。

实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。

JC-1稀释和使用时有一些特殊的要求，因此对于初次使用JC-1的用户或对于JC-1的使用不是非常熟悉的用户，我们建议使用碧云天的线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) (C2006)，该试剂盒配套提供了一些相关试剂，使用起来更加便捷。

本JC-1溶解在DMSO中，浓度为5mg/ml，共200μl。

包装清单：产品编号产品名称包装(5mg/ml)50μl/管，共4管C2005 JC-1—说明书1份保存条件：-20℃避光保存。

JC-1单标法和JC-1 PI双标法荧光探针检测山羊附睾精子线粒体膜功能的研究摘要：为准确、全面研究超低温冷冻技术对山羊附睾精子线粒体膜电位的影响效果，本试验采用荧光探针ＪＣ－１单标和ＪＣ－１／ＰＩ双标２种荧光染色方法，通过流式细胞仪和荧光显微镜两种检测手段对精子线粒体膜电位（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ，MMP）变化进行检测分析，用ＪＣ－１单独染色，能准确、快速地区分高、低ＭＭＰ精子，但不能明确区分精子的存活状态，采用ＪＣ－１与碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）双标法，则能明显判定精子的存活状态。

通过对绒山羊附睾精子在冷冻前和解冻后线粒体膜电位检测，结果表明，单标记后高ＭＭＰ精子尾部呈橙红色，低ＭＭＰ精子尾部为绿色；双标后死亡精子头部呈红色（ＰＩ＋）。

对两种检测手段的比较研究，结果显示，荧光显微镜能够有效地区分出高、低ＭＭＰ及死精子，但对于活精子中ＭＭＰ的高低检测效果不理想；流式细胞仪则能够有效地区分活精子ＭＭＰ的高低，而且结果准确，速度快，敏感性高。

试验表明，两种检测方法相关性很高，分析同一处理样品时用ＪＣ＋％和ＪＣ＋／ＰＩ－％检测结果呈显著正相关（ｒ＝０．８１５，ｒ＝０．９８２，Ｐ＜０．０１）。

因此，对于精子线粒体ＭＭＰ的分析，采用ＪＣ－１单染与ＪＣ－１／ＰＩ双染的方法，利用流式细胞仪与荧光显微镜进行联合检测，能比较全面、准确的反映出精子线粒体的功能状态。

关键词：山羊；精子；线粒体膜电位；ＪＣ－１线粒体是活性氧形成的主要场所，活性氧的生成是导致电子传递过程的中断，氧化磷酸化与电子传递的耦合是维持高的线粒体膜电位（△ψｍ）的重要环节，而这种高的线粒体膜电位状态是细胞和精子维持活性在线粒体中产生ＡＴＰ能量所必需的保障，因此，在精子整个代谢过程所需的能量主要由线粒体提供［１，２］。

线粒体活性的改变会影响精子的能量供应［３］，且线粒体还是细胞凋亡的调控中枢［４］。

线粒体膜电位检测方法线粒体是细胞内的重要器官，它们在细胞内起着能量生产和调控细胞代谢的重要作用。

线粒体膜电位是线粒体内膜和外膜之间的电化学梯度，是维持细胞内稳态的重要指标。

线粒体膜电位的检测对于研究细胞代谢、细胞凋亡、细胞内能量平衡等方面具有重要意义。

目前，有多种方法可以用来检测线粒体膜电位，本文将对其中几种常用的方法进行介绍和比较。

首先，常用的线粒体膜电位检测方法之一是荧光染料法。

这种方法利用荧光染料如JC-1、Rhodamine 123等，这些荧光染料可以穿过细胞膜，进入线粒体内，根据线粒体膜电位的变化而改变荧光强度。

当线粒体膜电位较高时，这些荧光染料会聚集在线粒体内，产生强荧光信号；而当线粒体膜电位下降时，这些荧光染料会从线粒体内释放出来，导致荧光信号的减弱。

通过检测荧光信号的变化，可以间接地反映线粒体膜电位的变化。

其次，膜电位敏感探针法也是一种常用的线粒体膜电位检测方法。

这种方法利用膜电位敏感探针如TMRM、Safranin O等，这些探针可以与线粒体内的负电荷结合，其荧光信号与线粒体膜电位呈正相关关系。

通过荧光显微镜或流式细胞仪等设备，可以直接观察和测量线粒体内的荧光信号强度，从而反映线粒体膜电位的变化。

另外，电生理技术也可以用来检测线粒体膜电位。

这种方法利用微电极直接穿透细胞膜，进入线粒体内测量膜电位。

通过记录电压信号的变化，可以准确地监测线粒体膜电位的动态变化。

虽然这种方法操作较为复杂，但其测量结果具有较高的准确性和灵敏度。

最后，生物传感器技术也可以用来检测线粒体膜电位。

生物传感器是一种能够将生物信号转化为可测量的电信号的装置，可以通过将线粒体膜电位与生物传感器相结合，实现对线粒体膜电位的实时监测和记录。

这种方法具有实时性强、操作简便等优点，逐渐成为线粒体膜电位检测的研究热点。

综上所述，线粒体膜电位的检测方法多种多样，每种方法都有其独特的优势和局限性。

在选择合适的检测方法时，需要根据具体的研究目的和实验条件进行综合考虑。

1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。

Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。

两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

右上象限为独立的核（FITC-/PI+）。

Annexin-V可以再钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。

PI是一种DNA染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI从而进入细胞核与DNA结合。

所以Annexin-V阴性-PI阴性代表正常细胞Annexin-V阳性-PI阴性代表凋亡早期的细胞Annexin-V阳性-PI阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞Annexin-V阴性-PI阳性一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是PI标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。

细胞凋亡调控实验报告一、实验目的细胞凋亡是一种由基因控制的细胞主动死亡过程，对于生物体的发育、稳态维持和疾病发生等具有重要意义。

本实验旨在探究不同因素对细胞凋亡的调控作用，深入理解细胞凋亡的分子机制。

二、实验原理细胞凋亡的发生涉及一系列复杂的信号转导通路和分子事件。

其中，线粒体途径、死亡受体途径以及内源性凋亡通路等是常见的调控途径。

通过使用特定的试剂和检测方法，可以观察细胞形态变化、检测凋亡相关蛋白的表达以及评估线粒体膜电位等指标，从而分析细胞凋亡的情况。

三、实验材料与方法（一）实验材料1、细胞系：选用人肝癌细胞系 HepG2 进行实验。

2、主要试剂：Annexin VFITC/PI 凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、蛋白酶抑制剂、细胞裂解液、抗体（如 Bcl-2、Bax、Caspase-3 等）、化学诱导剂（如顺铂）。

3、实验仪器：流式细胞仪、荧光显微镜、酶标仪、离心机、培养箱等。

（二）实验方法1、细胞培养将 HepG2 细胞接种于培养瓶中，加入含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，置于 37°C、5% CO2 培养箱中培养。

待细胞融合度达到 80%左右时，进行传代培养。

2、细胞凋亡诱导实验组分别加入不同浓度的顺铂处理细胞，设置不同的处理时间（如 24 小时、48 小时）。

对照组加入等体积的 DMSO 作为溶剂对照。

3、细胞凋亡检测采用 Annexin VFITC/PI 双染法结合流式细胞仪检测细胞凋亡率。

收集处理后的细胞，用 PBS 洗涤两次，加入 Annexin VFITC 和 PI 染色液，避光孵育 15 分钟，然后进行流式细胞仪检测。

4、线粒体膜电位检测使用线粒体膜电位检测试剂盒，处理细胞后，加入 JC-1 染色液，孵育 20 分钟。

荧光显微镜下观察细胞的荧光强度，红色荧光表示正常线粒体膜电位，绿色荧光表示降低的线粒体膜电位。

5、蛋白提取与 Western blot 检测收集细胞，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解 30 分钟。

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)简介：JC-1是一种检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) 的理想荧光探针。

在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。

这样就可以通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化，常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。

通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，这种转变也可作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

JC-1单体的最大激发波长为，最大发射波长为。

JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为，最大发射波长为。

实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的装置即可。

Leagene 线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一种以JC-1为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测，CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、 配制JC-1染色工作液：取适量JC-1 Stain (200×)，按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH 2O 的比例稀释JC-1，剧烈Vortex 充分溶解并混匀JC-1。

然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×)，混匀后即为JC-1染色工作液。

6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为，其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推； 对于细胞悬液每0.5～1.0×106细胞需JC-1染色工作液。

细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）JC-1 Apoptosis Detection Kit说明书修订日期：2019.7.24 Cat number：KGA601-KGA604Store at -20℃ for 12 monthsFor Research Use Only（科研专用）一、试剂盒说明大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关，其中线粒体跨膜电位（△ψ）的破坏，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

本试剂盒采用JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)一种阳离子脂质荧光染料作为检测线粒体跨膜电位指示剂。

JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存在，高浓度时以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同，但均可在流式细胞仪绿色（FL-1）通道检测出绿色荧光，JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光；可被流式细胞仪的红色（FL-2）通道检测到，而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。

根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。

本试剂盒可应用于细胞、组织或纯化的线粒体膜电位检测。

二、试剂盒组份组份KGA601 KGA602 KGA603 KGA604 储存条件10 assays 20 assays 50 assays 100 assaysJC-1 10µL 20µL 50µL 100µL -20℃,避光10×Incubation Buffer 2mL 4mL 10mL 20mL 2-8℃三、试剂盒以外自备仪器和试剂流式细胞仪或荧光显微镜、高速离心机、CO2培养箱、微量移液器1.5ml Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、灭菌去离子水四、使用注意事项1.微量试剂取用前请离心集液。

jc1线粒体膜电位流式（原创实用版）目录一、JC1 线粒体膜电位的检测原理二、JC1 的检测方法及应用三、JC1 的优缺点正文一、JC1 线粒体膜电位的检测原理线粒体膜电位是指线粒体内膜两侧的电位差，它是细胞能量代谢的关键指标之一。

JC1 是一种常用的线粒体膜电位检测染料，其原理是基于JC1 在不同浓度下呈现出不同的荧光颜色。

JC1 有单体和多聚体两种存在状态。

在低浓度时，JC1 以单体存在，此时可以检测到绿色荧光。

在流式检测中，通常使用 FL-1 通道（与 FITC 同通道）进行检测。

当 JC1 浓度较高时，它会以多聚体形式存在，此时可以检测到红色荧光。

在流式检测中，通常使用 FL-2 通道进行检测。

二、JC1 的检测方法及应用JC1 的检测方法主要包括荧光显微镜检测和流式细胞仪检测。

荧光显微镜检测是一种常用的方法，可以实时动态地观察线粒体膜电位的变化。

在实验中，只需将细胞与 JC1 染料共同培养，然后用荧光显微镜观察细胞中的绿色或红色荧光即可。

流式细胞仪检测是一种快速、高效的检测方法。

在实验中，将细胞与JC1 染料共同培养，然后用流式细胞仪检测细胞中 FL-1 和 FL-2 通道的荧光强度，从而得到线粒体膜电位的值。

JC1 染料广泛应用于生物能量代谢研究、药物筛选等领域。

三、JC1 的优缺点JC1 染料检测线粒体膜电位的优点有：1.检测速度快，流式细胞仪检测可在短时间内得到大量数据；2.检测结果准确，JC1 在不同浓度下呈现出不同的荧光颜色，可以实现定量检测；3.可以实时动态地观察线粒体膜电位的变化。

线粒体膜电位流式1. 简介线粒体是细胞中的一个重要细胞器，通过氧化磷酸化产生能量。

线粒体内外膜之间存在着电势差，称为线粒体膜电位。

线粒体膜电位的测量对于了解细胞能量代谢和细胞功能具有重要意义。

线粒体膜电位流式技术是一种通过荧光染料测量线粒体膜电位的方法。

2. 流式细胞仪原理流式细胞仪是一种高通量、多参数的细胞分析技术。

它通过将单个细胞在液态悬浮介质中依次通过激光束并记录散射光和荧光信号来实现对细胞的快速、准确分析。

利用流式细胞仪可以获取大量的细胞信息，包括大小、形态、表面标记物以及内部成分等。

3. 流式测量线粒体膜电位的原理在流式测量线粒体膜电位时，常用的荧光染料是JC-1（5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四(三苯基基)苯基二氢氯化物）。

JC-1可以通过荧光变色来反映线粒体膜电位的变化。

在正常细胞中，JC-1会聚集在线粒体内，形成聚集态（红色荧光）；而在线粒体膜电位下降的细胞中，JC-1则会散布在细胞质中，形成单体态（绿色荧光）。

4. 流程步骤流式测量线粒体膜电位的步骤如下：步骤一：细胞样品制备从培养皿中取出需要测量的细胞样品，并进行适当处理，如洗涤、离心等。

步骤二：荧光染料染色将适量的JC-1荧光染料加入细胞样品中，使其与细胞内部结合。

步骤三：孵育将染色后的细胞样品置于适宜的培养条件下孵育一段时间，以确保JC-1能够进入线粒体并形成聚集态。

步骤四：流式测量将孵育后的细胞样品注入流式细胞仪中，设置相应的参数并启动测量。

步骤五：数据分析通过流式细胞仪获取的数据可以通过相应的数据分析软件进行进一步处理和解读。

可以根据荧光信号的强度和比例来判断线粒体膜电位的高低。

5. 应用领域线粒体膜电位流式技术在生物学研究中具有广泛应用。

以下是一些典型的应用领域：肿瘤学研究线粒体膜电位在肿瘤细胞中常常发生改变，通过测量线粒体膜电位可以了解肿瘤细胞的能量代谢状态，并对肿瘤发生、发展机制进行深入研究。

神经科学线粒体膜电位与神经元活动密切相关，测量线粒体膜电位可以揭示神经元活动和功能变化的机制，对神经退行性疾病等相关研究具有重要意义。

线粒体膜电位是反映线粒体功能的重要参数，其检测有助于评估细胞的能量代谢状态以及细胞凋亡等过程。

肝癌细胞线粒体膜电位的检测方法可以采用荧光探针法，常用的荧光探针包括JC-1、Rhodamine 123等。

这些荧光探针可以与线粒体膜电位结合，发出荧光信号，从而反映线粒体膜电位的变化。

具体操作步骤如下：
1.收集肝癌细胞样本，并进行适当的处理，如洗涤、离心
等。

2.将荧光探针与肝癌细胞孵育，使荧光探针与线粒体膜电
位结合。

3.洗涤去除未结合的荧光探针。

4.使用荧光显微镜或流式细胞仪等设备检测荧光信号，分
析线粒体膜电位的变化。

需要注意的是，荧光探针法虽然简便易行，但也可能受到一些因素的干扰，如细胞自噬、线粒体膜通透性改变等。

因此，在实际应用中，需要综合考虑多种因素，选择适当的检测方法，并结合其他指标进行综合分析。

此外，线粒体膜电位的检测还可以采用其他方法，如电化学法、原子力显微镜等。

这些方法的原理和操作步骤各有不同，可以根据具体需求和条件进行选择。