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RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
编辑本段优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
此方法会产生较少的错误条带。
此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
编辑本段引物的设计基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
编辑本段反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
4中给出了所有引物的相互关系。
重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR 反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。
火灾应急处理程序race火灾是一种常见的自然灾害，它能够对人们的生命财产造成巨大的影响。
因此，企业需要制定应急处理程序和培训员工，以最大限度地减少火灾造成的伤害和损失。
火灾应急处理程序其实就是一个计划，旨在最大限度地减少火灾对人员生命和企业财产的危害。
执行该程序需要一个点火的方法论。
该方法论被称为“Race”。
RACE是一个简单但有效的模型，可用于应对火灾的紧急情况。
RACE代表的是四个步骤：R - Rescue（疏散），A - Alarm（警报），C - Contain （火源封禁），E - Extinguish（灭火）。
第一步：R - Rescue（疏散）如果发生火灾，人员的安全是最重要的。
员工应该迅速采取行动，帮助他们自己和其他人疏散。
首先，员工需要了解他们的撤离路径和标志。
如果没有这些，员工必须找到最近的撤离路线，并按照标志或指示牌上的指示进行操作。
让员工在火场或已阻塞的出口互相帮助，并遵守正式的疏散过程。
一旦他们到达安全区域，他们必须在那里等待直到受到额外的指示。
第二步：A - Alarm（警报）告诉其他人发现火灾是非常重要的，这样他们就可以帮忙报警和维持安全。
使用适当的报警方法通知体制内的所有人，以便他们可以采取必要的行动，并且消防队可以立即派遣。
如果安装有消防器材，员工必须也尽可能集中在特定点，避免重复报警。
在通报过程中，员工需要清楚地传达有关火灾地点，火势、疏散路线、人员地点和必需的信息，以便消防人员可以尽快到达现场。
第三步：C - Contain（火源封禁）在报警的同时，员工应该尝试封堵火源，这也可以帮助减轻火势和扩散的速度。
每个员工都应该了解消防设备的位置，以便可以保存适当的工具。
如果是小火源的话，员工可以通过使用灭火器或扑橘进行灭火。
如果火势较大，员工可以使用肮脏水或防火门等方法封堵火源。
如果员工没有消防训练或无法确定火源的位置，那么最好避免进行随意的灭火行动。
第四步：E - Extinguish（灭火）只有在初步封堵火源的情况下，才能进行灭火。
消防火灾应急处理流程race 消防火灾应急处理流程火灾是一种非常危险的自然灾害，发生火灾的时候，人们要迅速做出应急处理，才能够有效地防止火灾造成的损失。
在消防员的家中，有一套紧急处理火灾的流程，这个流程被称为“race”，这个词代表了这个流程的四个步骤，即“反应、调查、扑灭、评估”。
下面分别介绍这四个步骤的具体内容。
一、反应(React)在火灾突然发生的时候，人们应该快速反应，这个步骤是一切应急处理流程的起点。
在这个步骤中，人们的目的是将所有的居民和宠物尽快地转移到安全的地方去，如果发现燃烧的区域可以用灭火器或其他工具扑灭，可以在这个时候马上行动。
当然，最重要的目标是确保所有人都能够安全撤离受灾现场。
二、调查(Assemble)调查是一个完整的过程，可以分为两个步骤进行。
首先，要求每个人在他们离开区域之前向消防人员或其他相关机构提供尽可能多的信息，以帮助他们确定火灾的位置和严重程度。
这些信息包括火灾的大小、火焰的颜色、肆虐的区域、被困人员的情况等等。
在获得这些信息之后，应该马上组成一支灭火队伍，实施有组织的灭火行动。
在这个过程中，应该严格管理资源，防止造成浪费或重叠。
三、扑灭(Combat)在这个步骤中，消防队员要快速、高效地应对火灾，使用各种消防设备，包括水、泡沫、粉末以及气体灭火剂等等。
根据实际灭火的情况，消防队员可以使用一定数量的灭火器，或者使用大型消防车。
四、评估(Evacuate)这个步骤是为了确定火灾的真实情况，以及整个事件所造成的损失。
在火灾被扑灭之后，需要进行一次详细的评估，以确定损失的程度和原因。
如果火灾的原因是由电器故障、天气恶劣或其他原因造成的，人们需要尽可能多地了解细节，以便他们在未来采取更有效的措施来防止火灾的发生。
在消防火灾应急处理流程中，每个步骤都非常重要，如果其中任何一个环节有失误，将可能导致火灾的扩大和损失的增加。
因此，在火灾发生前，我们应该通过各种途径，提高人们的火灾安全意识，让人们掌握基本的灭火技能和火灾逃生常识，从而为火灾的处理提供更多的帮助。
火灾发生的处理步骤是race火灾是一种严重的自然灾害，它蔓延迅速并且对人类的生命财产造成巨大破坏。
在火灾发生的时候，我们需要迅速采取一系列的应对措施来确保人员的安全，并且控制火势的蔓延。
那么，如何有效地应对火灾呢？本文就介绍一个经典的处理步骤：RACE。
RACE的含义是：R——Rescue（安全撤离）A——Alarm（报警）C——Contain（控制火势）E——Extinguish（灭火）在火灾发生时，我们必须第一时间确保人员的安全，因此，第一步就是Rescue（安全撤离）。
我们需要确保所有的人员都能够迅速撤离火灾现场到达安全区域。
在这个过程中，我们需要注意以下几点：1. 在火灾初期，不要开启电梯。
2. 遇到火灾时不要使用电梯，需要使用楼梯。
3. 在疏散过程中，不要使用大声喊叫的方式引发恐慌。
4. 在疏散过程中，不要逆着人流。
除了确保所有人员的安全，我们还需要及时触发Alarm （报警）程序，通报有关部门进行救援。
在火灾初期蔓延不大时，我们可以使用简单的火警手报警器或拨打当地火警电话，不同的情况可以选择不同的报警方式。
在报警的过程中，我们需要确保提供准确的信息，如火灾地点、火势情况、人数等。
接下来是Contain（控制火势），这一步是确保火灾不再继续蔓延。
我们需要尽快采取以下措施：1. 关闭所有的门窗，以防火势蔓延。
2. 将易燃物品等尽量远离火源。
3. 在适当的时候，喷射灭火器等物品以制止火势。
4. 封锁供电、供气、供水等设施以防止火势进一步扩大。
最后是Extinguish（灭火），这将是最后一步，只有控制火势后，我们才可以开始灭火。
在灭火的过程中，我们需要做到以下几点：1. 打开灭火器，使用正确的手段灭火。
2. 使用灭火毯覆盖火源，以减缓烟火扩散。
3. 打开喷水设备，冷却火源。
注意不要用水灭油火。
在灭火的过程中，我们需要知道不同的灭火方式和材料所需的灭火方法，还需要注意是否有危险物品在周围环境中。
RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。
但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。
cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5' 和3' 端，包括单边PCR和锚定PCR。
该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespalova等，1998：Matz等11999）。
对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo(dT)引物的3' 端引入两个简并的核苷酸[5'-Oligo(dT)16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T]，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA 聚合酶可能在高温（60℃~70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5' 端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR（hot start PCR）技术和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。
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RACE技术的原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术是一种用于扩增cDNA末端序列的方法，广泛应用于克隆和鉴定未知基因的研究中。
下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。
一、原理：RACE技术是通过逆转录反应将RNA转录成cDNA，然后利用特殊的引物设计，通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，最终得到所需的cDNA末端序列。
RACE技术主要包括5'-RACE和3'-RACE两个步骤。
5'-RACE：用于扩增未知序列的5'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行逆转录反应，得到第一链cDNA。
2.利用聚dT载体和逆转录酶进行第二链合成。
3.利用内源引物（如具有较高表达的基因的已知序列）和外源引物A 进行PCR扩增。
4. 应用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
5.得到扩增的特异性产物后，纯化PCR产物并进行测序分析，获得5'端的未知序列。
3'-RACE：用于扩增未知序列的3'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行反转录反应。
2.利用特异性引物（如基因的已知3'端序列）和逆转录酶进行第一轮PCR扩增。
3. 利用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
4.纯化PCR产物并进行测序分析，获得3'端的未知序列。
二、操作：1. 提取总RNA：一般使用RNAiso Plus试剂或类似试剂从细胞或组织中提取总RNA。
2. 逆转录反应：利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
逆转录酶一般有M-MLV逆转录酶和SuperScript III等。
3.第一链合成：利用聚克隆酶将逆转录的cDNA合成第一链，即得到第一链cDNA。
4.第二链合成：利用特殊的引物和逆转录酶将第一链cDNA合成第二链。
1）RNA 提取采用试剂Trizol Reagent (购自invitrogen 公司)2）氯仿；异丙醇；70 % 乙醇；0.1 % DEPC；DEPC 处理的超纯水(2) 聚合酶链式反应（PCR）、核酸电泳试剂1) Tris-硼酸储存（5×TBE）缓冲液：54g Tris 碱，27.5 g 硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)溶于1000 ml 水。
2) 溴化乙啶（10 mg/ml）:100 ml 水中加入1 g 溴化乙啶，磁力搅拌数小时至溶解，避光保存3）点样缓冲液Loading buffer(10×): 0.25 %溴酚蓝，40 %甘油。
4）Ex Taq DNA Polymerase（TaKaRa），琼脂糖DNA 胶回收试剂盒(北京天根生物公司)5）DNA Makers：DL2000，DNA Maker Ⅲ6) 特异引物（上海生工合成）7) 5'RACE 试剂盒购置大连宝生物工程有限公司(3) 目的基因鉴定、培养基及培养液1）液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0g，调pH 至7.0，定容至1L，高压灭菌。
2）固体培养基：加琼脂15g/L，高压灭菌。
3）氨苄50μg/mL；IPTG 25 mg/mL；X-Gal 25 mg/mL 溶于DMF 中4）5×KCM 溶液3.73 g KCl，2.21 g CaCl2，5.08 g MgCl2，定容至100 ml。
总RNA 的提取实验用品的处理：离心管、枪头等塑料制品用0.1 % DEPC于37 ℃浸泡2h，和0.1 %的DEPC 水高压灭菌30min，研体、剪刀、镊子、容量瓶等180℃烘烤6h。
1）称取100 mg小麦叶片，液氮研磨至粉末状，迅速转入含1mL Trizol的1.5 ml离心管中，混匀，室温下静置5 min。
2）加0.2 ml氯仿，剧烈振摇15 sec，20 ℃静置3 min。
3）然后在4℃，12000 rmp 离心10 min，吸取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，置于-20℃放置30 min。
4）在4℃，12000 rmp 离心10 min，弃去上清液，沉淀中加1mL 75% 乙醇洗涤。
5）4℃，12000 rmp 离心5 min，弃去上层乙醇，放置几分钟，等乙醇挥发完加入50uLDEPC 水溶解RNA，并迅速置于-70℃存放。
6）取上述RNA提取溶液，1 %琼脂糖电泳检测。
(3) RT（反转录）合成cDNA 第一链用提取的小麦幼苗总RNA 为模板，Oligo(dT)30为引物，由M-MLV 反转录酶合成cDNA 第一链，RT-PCR 反转录体系25μL：向PCR 管中加入RNA 6μL，RNase free ddH2O6μL，Oligo (dT)301μL，70℃5min（破坏RNA 二级结构），冰浴冷却，再加入5μL dNTP （2.5 mmol/L），5μL RT Buffer，RNase inhibitor 1μL，反转录酶MMLV 1μL，42 ℃反应1h，RT-PCR 产物-20 ℃保存。
(4) PCR 扩增PCR 扩增体系为50 μL：反转录产物5μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus）5μL，TaKaRa Ex Taq（5U/μL）0.25μL，W1219(sense)(10 mmol/L) 2μL，W0802(anti-sense)(10mmol/L) 2μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4μL,ddH2O 31.75μL；反应程序为：95 ℃5min，94 ℃30 s，57 ℃1 min，72 ℃1 min，72 ℃10 min，循环数30。
反应完毕后，取2μL进行 1 %琼脂糖电泳检测。
(5) 3'RACE 扩增小麦脱水素基因wzy2 3'端反应体系见表2-1。
试剂用量（μl）10×Ex Taq Buffer （Mg2+Plus）5TaKaRa Ex Taq（5U/μL）0.25dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4W1219（10 mmol/L）2Oligo（dT）30（10 mmol/L）2cDNA 第一链5ddH2O 补至总体积50μl。
反应程序为：95℃5 min，94 ℃30 s，61 ℃1 min，72 ℃1 min，72 ℃10 min，循环数30。
反应完毕后，取2μL 进行 1 %琼脂糖电泳检测。
(6) PCR 产物回收用TIANGEN 的DNA 凝胶回收试剂盒1）在紫外灯下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，置于1.5mL 离心管，称重，以1mg相当于1μL 的等量关系，加入 3 倍体积的溶胶液PN，50 ℃水浴放置10 min，期间不断温和地摇动离心管，至凝胶完全溶解。
2）将试剂盒中的Spin Column 放于2mL 的收集管上，把上一步得到的溶胶液加入到Spin Column ，13000 rpm 离心30s ，弃去收集管中的废液。
3）向Spin Column 中加入700 μL 的漂洗液PW ，13000 rpm 离心30s，弃去废液。
再向Spin Column 中加入500 μL 的漂洗液PW，13000 rpm 离心30s，弃去废液。
4）将Spin Column 13000 rpm 离心2min ，置于室温5 min，晾干，应尽量除去漂洗液。
5）将Spin Column 置于一个干净的1.5 mL 的离心管，在Spin Column 柱中央滴加50 μL 的DNA 洗脱液EB，室温放置2 min，13000 rpm 离心2 min 收集目的DNA。
将回收产物经琼脂糖凝胶电泳检测后存放于-20 ℃。
(7) 回收产物与载体的连接目的DNA 3μl2×buffer 5μl，T4DNA 酶1μl，PGEM-T easy 载体1μl连接体系为10 μL，4 ℃连接过夜。
(8) 感受态细胞JM109 的制备与转化1）感受态细胞JM109 的制备A. 溶液配制：TSS：85 % LB 培养基，10 % PEG（w/v），5 % DMSO（v/v），50 mmol/LMgCl2（pH6.5）B. 感受态制备：a. 取无抗生素平板上生长良好的JM109 单菌落，接种于5 mL LB 液体培养基中，37℃震荡过夜。
b. 取500 μL 过夜JM 109 菌液于100 mL 液体培养基中，37 ℃震荡至OD600=0.4c. 置于冰浴30min，使培养物冷却至0℃，4℃以4000 rpm 离心10 min 回收细胞，去掉上清液，收集菌体。
d. 每50 mL 初始培养物用5 mL 冰上预冷的TSS 悬浮，洗去剩余的培养基和菌落的次生代谢物，4℃以4000 rpm 离心10 min 回收细胞，去掉上清，收集菌体。
e. 每50 mL 初始培养物用2 mL 冰上预冷的TSS 悬浮，将感受态细胞分装成200 μL每管，立即放入-80 ℃冰箱备用。
2）KCM 法转化A. 200 μL 感受态细胞，冰上解冻后，加入5×KCM 20μL、连接产物10μL、ddH2O 70μL，混合均匀，冰浴25 min。
B. 37 ℃热激5 min，冰浴冷却2 min，加入800 μL LB 液体培养基，于37℃170 rpm 震荡复苏50 min。
C. 将复苏后的菌液8000 转/min 离心1min，弃去上清800 μL，重悬细胞，涂板（IPTG17 μl，X-Gal 32 μl）。
(9) 重组菌的筛选和鉴定1）蓝白斑筛选在平板上挑选出白斑进行菌落PCR（PCR 程序同前），并将蓝斑作为阴性对照，根据能否扩增出目的条带初步筛选出阳性克隆，同时对白斑进行扩大培养。
2）提取白斑菌落的质粒，进行质粒PCR（PCR 程序同前）及酶切鉴定，并对确定的阳性菌进行DNA 测序。
2.1.2.2 5'RACE 扩增小麦脱水素基因wzy2 5'末端(1) 小麦幼苗干旱胁迫处理及总RNA 的提取方法同上。
(2) 去磷酸化处理。
使用Alkaline Phosphatase（CIAP）对Total RNA中裸露的5′磷酸基团进行去磷酸反应。
a. 按照表2-2配制去磷酸反应液。
去磷酸反应液的配制Total RNA（1 μg/μL）2 μLRNase Inhibitor（40 U/μL）1 μL10×Alkaline Phosphatase Buffer（MgCl2Free）5 μLAlkaline Phosphatase（Calf intestine）（16 U/μL）0.6 μLRNase Free dH2O up to 50 μLb. 50℃反应1h。
c. 向上述反应液中加入20 μL的3 M CH3COONa（pH5.2），130 μL的RNase Free dH2O后，充分混匀。
d. 加入200 μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1），充分混匀后13 000×g室温离心5min，将上层水相转移至新的Microtube中。
e. 加入200 μL的氯仿，充分混匀后13 000×g室温离心5min，将上层水相转移至新的Microtube中。
f. 加入2 μL的NA Carrier后均匀混合。
g. 加入200 μL的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10min。
h. 13 000×g 4 ℃离心20min，弃去上清液。
i. 加入500 μL的70 %冷乙醇（RNase Free dH2O配制）漂洗，离心5min，弃上清后干燥。
j. 加入7 μL的RNase Free dH2O溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。
(3) “去帽子”反应。
使用TobaccoAcidPyrophosphatase（TAP）去掉mRNA的5′帽子结构，保留一个磷酸基团。
“去帽子”反应液配制CIAP-treated RNA 7 μLRNase Inhibitor（40 U/μL）1 μL10×TAP Reaction Buffer 1 μLTobacco Acid Pyrophosphatase（0.5 U/μL）1 μLTotal Volume 10 μLb. 37℃反应1h。
c. 此反应液为CIAP/TAP-treated RNA。
取5 μL用于5′RACE Adaptor连接反应，剩余的5μL保存于-80℃。
(4) 5′RACE Adaptor的连接。
a. 首先配制下列溶液。
5′RACE Adaptor的连接液的配制（1）CIAP/TAP-treated RNA 5 μL5′RACE Adaptor（15 mmol/L）1 μLRNase Free dH2O 4 μLb.65℃保温5min后冰上放置2分钟，然后加入下列试剂。
