western blot方法

Western blot

一、Western blot历史及原理

蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，简称WB。1975年，继Edwin Southern发明的“Southern Blot”，1977年George Stark及其同事发明的“Northern Blot”技术之后，受以上两个“转印”技术的启示，1981年“Western Blot”这一技术正式问世。抗体技术的发展，电泳及转膜技术的改进使得Western Blot操作日益简单；分析方法及工具多样化、成像技术的革新、高灵敏度示标信号的出现使得Western Blot的检测范围得到扩展，定量/半定量成为可能。目前Western Blot设备不断更新、技术不断发展，WB仍将在较长时间和应用领域内得到更加广泛的应用，其检测灵敏度也将不断提高。

其基本原理与ELISA相似：通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离混合蛋白质样品，转印到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以转印到固相载体上的蛋白质（多肽）作为抗原，与对应的抗体（又称一抗）特异性结合，特异性抗体再与酶、荧光素或同位素标记的抗一抗抗体（又称二抗）起反应，经过底物显色或放射自显影以检测样品中特异性蛋白（见图1）。一抗的质量是WB成功的关键，现在市面上抗体公司很多，一般选择大公司大品牌的抗体对于实验的成功很有保证。但是由于实验经费的限制只能选择小公司或国产二线品牌的抗体，这个时候需要使用者尽可能多考究：①完整的质检数据；②售后承诺；③技术人员对产品的熟悉程度。对于二抗来说，选择就更需谨慎，虽然二抗看似简单，其质量却千差万别，对实验结果的影响也尤为重要。福因德科技（Frdbio）专注于免疫检测产品的开发和工艺研究，只做精品；如果客户购买的产品质量达不到标明的水平，无条件退货。对于WB的底物是根据二抗的标记酶来确定的，有大家较为熟悉的辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，）和碱性磷酸酶AP（Alkaline

western-blot实验方法

1、试剂耗材的准备：

（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：

（2）10 × 丽春红染液：

（3）TBS 缓冲液：

（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：

（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：

（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。

（7）底物显色液

ECL，4℃ 避光保存，现用现配。

（8）显影液和定影液

用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。室温避光存放。

2、实验步骤：

（1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。 （2）取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。

（3）转膜：（转膜缓冲液4 ℃ 预冷备用，冷却装置于- 80 ℃ 冰箱冷冻备用）。

（4）将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（5）戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜（83 mm × 75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec，直到膜变半透明。用纯水冲洗膜2 次。浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（6）SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min

- 1 hr 之间。

（7）将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。将膜与凝胶对齐。用玻璃棒赶走气泡。

（8）将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。放入电转槽中。使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。

（9）将电转槽放在冰水盒中。将预冻的冷却装置放入槽内。 缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。

（10）盖好盖子，接上电源。根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。

Western blot protocol

步骤：

1. 分离胶和积层胶，制胶板；

注意：灌分离胶时不要加太多。

2. 蛋白变性：准备蛋白样本，加入等体积的2×上样Buffer稀释，置于沸水中煮10min（预染marker煮5min）

3. 加样：每孔加入20～40μl样品

4. 电泳：置于电泳槽中电泳45min，恒定电流90mA（2块板），如为1块板则电流为50mA；

5. 取出胶板，用切割刀修好胶；

6. 将胶置于转膜液中浸泡；

7. 按顺序放好下列物质：黑面→海绵→滤纸→胶→NC膜→滤纸（用吸管赶去气泡）→海绵；

8. 置于转膜槽中于，黑面对黑面，加上冰块，加入转膜液；

9. 装好电极，于恒定电压100V下，90min；

10. 丽春红染膜；

11. 用TBST洗去丽春红；

12. 封闭：加入5％脱脂奶粉＋TBST，常温摇床摇1h；

13. 回收封闭液，加入一抗【一抗用5％BSA＋TBS稀释】；

14. 置于4℃摇床摇过夜；

15. 回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次；

16. 加入二抗【二抗用5％脱脂奶粉＋TBS稀释】，常温摇床摇1h；

17. 回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次；

18. 将膜置于发光液中浸泡约1min；

19. 将膜铺于曝光盒中，于暗室中曝光，洗胶片。

常用溶液配制：

Ⅰ 细胞裂解液（PLC Lysis Buffer）

Final concentration 100ml 500ml

1M Hepes(pH7.5) 50mM 5ml 25ml

5M NaCl 150mM 3ml 15ml

Glycerol 10% 10ml 50ml

50mM MgCl2 1.5mM 3ml 15ml

Triton×100 1% 1ml 5ml

0.5M

EDTA(pH8.0) 1mM 200μl 1ml

0.1M NaPPi 10mM 10ml 50ml

0.5M NaF 10Mm 2ml

B 免疫印迹主要步骤

1） 蛋白提取

取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。95°C水浴5分钟。10000g 4°C离心30分钟，取上清。每管20μl 分装。

2）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白提取液加入1/5体积的6倍上样缓冲液，目标蛋白SPAR、NR2A、NR2B、NR1、PSD-95和Actin使用7.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。浓缩胶使用80V 恒压约1小时，分离胶使用120V 恒压1-2小时。 整个过程电泳槽使用冰浴自来水降温。

3） 转膜和封闭

取6张与凝胶大小相同的滤纸和1张PVDF膜，100%甲醇浸泡PVDF膜15秒活化。把滤纸和活化后的PVDF膜一起浸泡到转膜缓冲液中。

将电泳后的凝胶放置于等面积的PVDF膜上，然后夹在滤纸中，滤纸上下各三层，挤走夹层中的气泡。将夹层物放置于电极之中，膜一面朝向正极，接通电源，25mA 恒流电转移过夜。

带有分离蛋白的PVDF膜放入10%脱脂牛奶TBS-T溶液中，37°C封闭1.5小时。

5） 一抗二抗孵育

弃去封闭液，PVDF膜装于加有相应的一抗的塑料袋，再用封口机将塑料袋封上，一抗的量为150 μl/cm2，所有抗体均用加入5%BSA和0.02%叠氮钠的TBS-T稀释，37°C温浴1小时40分钟。SPAR一抗来自于美国乔治敦大学Pak教授的馈赠，其它抗体均为商业来源，抗体的浓度根据实际情况进行调整，但是同一批实验在预实验条件确定以后，使用相同的抗体浓度。

SPAR抗体（1:400稀释）；NR2B抗体 (1:500稀释; Millipore, 美国)；NR2A抗体 (1:1,000稀释; Abcam, 英国)；PSD-95抗体 (1:4,000稀释; Affinity BioReagents,

美国)；Actin抗体 (1:3,000稀释; Santa Cruz Biotechnology, 美国)。