毒理学 实验三、微核试验

环境毒理学实验:吴天真班级：生物1501学号：201547005联系方式：队友：高秋远梁旭实验一污染物对藻类的生长抑制作用一、实验目的1. 了解藻类的生长规律；2. 掌握藻类的培养方法；3. 掌握化学物质对单细胞绿藻生长影响的评价方法。

二、实验容1. 运用毒理学实验方法，观察藻类在含有化学污染物的水环境中的生长抑制情况；2. 求出受试化合物对藻类生长抑制的EC50；3. 阐明受试化合物的剂量－效应关系与生长抑制特征。

三、实验原理单细胞藻类个体小、世代时间短，是水体中的初级生产者。

因为可在短期获得化学物质对其许多世代及种群水平上的影响，所以利用污染物对藻类生长的抑制作用，能反映污染物水平对水体中的初级生产者的作用情况。

通过将不同浓度的受试物加到属于对数生长期的藻类中，在规定的实验条件下继续培养，每隔24 h 测定藻类种群的浓度或生物量，以观察受试物对藻类生长的抑制作用。

经方差分析或t 检验，显著低于对照(p < 0.05)的生长率表明藻类生长受到抑制。

四、实验仪器和试剂1. 受试物研究藻类生长抑制实验的受试物应当是挥发性低、环境稳定性好且可溶于水的物质。

如果需要助溶剂，它在水中的浓度不能超过0.1 mL/L。

2. 藻种斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)或蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。

3. 培养基藻类的培养基很多，其成分和浓度各不相同，小球藻和栅藻可用“水生4 号”培养基培养。

配制培养基时可将营养盐类按所需浓度直接加入无菌蒸馏水或去离子水中。

应按顺序逐个加入，待一种盐类完全溶解后再加另一种。

亦可先配制各种营养盐类的浓度储液，经灭菌后避光冷藏保存。

当需要配制营养基时，将一定量的浓储备液摇匀，依次加入到蒸馏水或去离子水中即可。

*取少量菜园土，加2-3 倍自来水，煮沸10 余分钟，冷却后用滤纸过滤即可使用。

4. 实验器材电子天平(2 台)、立式压力蒸汽灭菌器(2 台)、无菌操作台(4 台)、显微镜(4 台)、生化培养箱(2 台)、pH 计(4 套)、气浴恒温摇床(4 台)、可见分光光度计(4 台)、数字照度计(2 台)、血球计(4 套)、血小球记数板(200 块)、4 到7 只30W 的普通白色荧光灯、ф60 漏斗(4 个)、锥形瓶、温度计、滤纸和纱布等若干。

蚕豆根尖微核实验摘要：本实验用洗发水诱导蚕豆根尖发生畸变，通过固定、酸解、，染色、压片、镜检等一系列过程观察蚕豆根尖细胞核及微核，通过微核的数量判断洗发水对人体毒害作用的大小。

由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，因此可用微核实验来评价各种诱变因子对生物遗传物质的影响程度。

关键词：蚕豆根尖微核卡诺固定液吉姆萨染液前言：随着相关研究人员的一系列实验表明：日常用品中的一些物质会对植物细胞尤其是分生组织细胞产生明显影响，它们会破坏细胞中的遗传物质——染色体，导致微核的产生，破坏细胞正常的生命活动。

微核（micronucleus,简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。

在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。

蚕豆根尖细胞的微核是由于根尖细胞在分裂时受到外界诱变因子作用，形成的不随细胞分裂进入细胞核的染色体片段。

以观察细胞中微核的形成来检测遗传毒物，称为微核实验。

利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。

目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。

1．材料1.1实验材料：蚕豆（根尖细胞的染色体大，DNA含量高，对诱变因子反应敏感）1.2实验药品：1mol/L盐酸、固定液（乙醇、冰醋酸3：1配制）、吉姆萨染液1.3实验用具：显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、盆、纱布、烧杯、水浴锅等2．步骤2.1 浸种催芽将试验所用适量蚕豆放入盛水烧杯盆中，在室温下浸泡1d。

种子吸胀后，用温润纱布松散包裹蚕豆置盆中，保持温度催芽2d，此时根长出将近约1.5cm。

2.2 毒性处理选取根生长良好，根长一致的种子，分成两组，一组放入盛有被测洗发水的盆中，被测液浸没根尖即可。

另一组放入盛有自来水的盆中培养，做对照组。

毒理学实验技术总结毒理学作为一门研究外源性化学物质对生物体产生有害作用的学科，其实验技术对于评估化学物质的毒性、安全性以及环境风险具有至关重要的意义。

在这篇文章中，我们将对常见的毒理学实验技术进行总结和介绍。

一、急性毒性实验急性毒性实验是评估化学物质在短时间内对生物体产生毒性作用的重要方法。

实验通常采用经口、经皮、吸入等途径给予受试物，观察受试动物在 24 小时至 14 天内的中毒症状和死亡情况。

通过计算半数致死剂量（LD50）或半数致死浓度（LC50）来衡量化学物质的急性毒性强度。

急性毒性实验可以初步了解化学物质的毒性特征，为后续的慢性毒性实验和风险评估提供基础数据。

在进行急性毒性实验时，需要严格控制实验条件，如受试动物的种类、年龄、体重、性别等，以及受试物的给予剂量和方式。

同时，要密切观察受试动物的行为、生理和病理变化，及时记录和处理实验数据。

二、慢性毒性实验慢性毒性实验是研究化学物质长期低剂量暴露对生物体产生的毒性作用。

实验周期通常为数月至数年，旨在观察受试动物在长期接触受试物后的生长发育、生殖功能、免疫功能、致癌性等方面的变化。

慢性毒性实验可以更全面地评估化学物质的潜在危害，为制定安全标准和防护措施提供依据。

慢性毒性实验的设计和实施较为复杂，需要考虑受试物的蓄积性、代谢途径、靶器官等因素。

实验过程中要定期对受试动物进行体检、血液生化指标检测、组织病理学检查等，以评估受试物对各个系统和器官的影响。

三、遗传毒性实验遗传毒性实验用于检测化学物质对生物体遗传物质（DNA）的损伤作用。

常见的遗传毒性实验方法包括基因突变实验（如 Ames 试验）、染色体畸变实验（如微核试验）和 DNA 损伤修复实验等。

这些实验可以帮助评估化学物质的致癌性和致畸性风险。

Ames 试验是一种常用的基因突变实验，通过检测受试物对鼠伤寒沙门氏菌的回复突变率来判断其致突变性。

微核试验则是通过观察细胞中的微核形成情况来评估染色体损伤程度。

毒理学实验技术总结毒理学是一门研究外源化学物、物理因素和生物因素对生物体产生有害作用的科学。

而毒理学实验技术则是研究这些有害作用的重要手段。

通过一系列的实验操作和观察，我们能够评估物质的毒性、确定安全剂量范围，为保护人类健康和环境安全提供科学依据。

接下来，让我们详细了解一下毒理学实验技术。

一、急性毒性实验急性毒性实验是毒理学中最常见的实验之一，其目的是测定化学物质在短时间内（通常为 24 小时至 14 天）对生物体造成的损害。

实验通常采用两种方法：经口急性毒性实验和经皮急性毒性实验。

经口急性毒性实验是将化学物质以特定的剂量灌胃给予实验动物，然后观察动物在短期内出现的中毒症状和死亡情况。

通过计算半数致死剂量（LD50）来评估物质的毒性强度。

LD50 越小，说明物质的毒性越强。

经皮急性毒性实验则是将化学物质涂抹在动物的皮肤上，观察其对皮肤的刺激性以及可能产生的全身性毒性反应。

在进行急性毒性实验时，需要严格控制实验条件，包括实验动物的种类、年龄、体重、性别等，以及化学物质的给予方式和剂量。

同时，要对实验动物进行密切观察，记录其症状出现的时间、严重程度和持续时间等。

二、亚慢性和慢性毒性实验与急性毒性实验不同，亚慢性和慢性毒性实验的观察周期较长。

亚慢性毒性实验的观察期通常为 90 天左右，而慢性毒性实验则可能持续一年甚至更长时间。

这些实验旨在评估化学物质在长期低剂量暴露下对生物体产生的潜在危害，如对器官功能的影响、致癌性、致畸性等。

实验过程中，需要定期监测实验动物的体重、饮食、行为、血液生化指标等，并在实验结束时对动物进行解剖，检查各个器官的病理变化。

三、遗传毒性实验遗传毒性实验用于检测化学物质对生物体遗传物质的损害作用，包括基因突变、染色体畸变和 DNA 损伤等。

常见的遗传毒性实验方法有：1、细菌回复突变实验（Ames 实验）：通过检测化学物质对细菌基因突变的诱导作用，来评估其遗传毒性。

2、微核实验：观察细胞中微核的形成，以判断化学物质是否导致染色体损伤。

实验三小鼠骨髓细胞微核试验实验三：小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的本实验旨在通过观察小鼠骨髓细胞微核率的变化，了解并评估骨髓细胞受到的损伤程度，为进一步研究生物样品中的毒性物质及其潜在危害提供依据。

二、实验原理微核试验是一种检测染色体畸变的快速、敏感的方法，常用于评价各种因素对机体的遗传毒性。

微核是由染色体的片段或整个染色体在细胞分裂后期或末期未能进入子代细胞核而形成的，因此微核率的高低可反映细胞染色体受损的程度。

骨髓细胞微核试验常用于检测体内外接触毒物的程度及检测药物的遗传毒性。

三、实验步骤1.选取健康的成年小鼠，进行试验前处理，包括脱毛、称重等。

2.对小鼠进行腹腔注射或口服给予不同剂量的待测毒物。

3.分别于24小时、48小时和72小时三个时间段采集小鼠骨髓细胞，制备骨髓细胞涂片。

4.对涂片进行染色处理，以便观察和计数。

5.在显微镜下观察每个涂片，记录微核数并计算微核率。

6.统计分析数据，对比不同剂量组与对照组的微核率差异。

7.根据实验结果，评估待测毒物的遗传毒性及对骨髓细胞的损伤程度。

四、实验结果与数据分析经过对小鼠骨髓细胞微核率的观察和计数，我们得到了不同剂量组与对照组的微核率数据。

通过对比分析，我们发现随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。

这表明待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致骨髓细胞的损伤。

为了更直观地展示实验结果，我们可以使用柱状图或折线图来表示不同剂量组与对照组之间的微核率差异。

通过观察图表，可以清楚地看到随着毒物剂量的增加，微核率也逐渐升高。

这进一步证实了待测毒物的遗传毒性和对骨髓细胞的损伤作用。

五、实验结论通过本实验，我们得出以下结论：1.待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致小鼠骨髓细胞的损伤。

2.随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。

3.实验结果提示，待测毒物可能对机体产生一定的危害作用，需要进一步研究其对人体健康的潜在影响。

4.微核试验作为一种快速、敏感的检测方法，可用于评估生物样品中的毒性物质及其潜在危害。

实验目的：1.了解环境毒理学的基本研究方法；2.了解化学污染物对蚕豆根尖细胞的遗传毒性；3.了解环境污染状况的生物学评价方法。

实验原理：1、了解有丝分裂不同时期特点、微核的形成和定义一般认为微核是真核细胞在有丝分裂过程中，染色体发生断裂后,由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的。

但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核，这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥，形成了第三个小核，即MCN。

显微镜下观察分裂间期的细胞，可见MCN呈圆形或椭圆形；游离于主核之外，在细胞质中；大小在主核1／3以下；微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样（染色深浅一致）。

微核形成主要由外界损害因素(生物、物理、化学)作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂而引起。

已经证实微核率的大小和染毒的剂量或辐射累积效应呈正相关，用受试物处理正在分裂的细胞，如果能检测到间期微核，且与自然状况下有明显差异，就可以直接推测该受试物是诱变物质，对生物有遗传危害。

目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。

预习：画出植物细胞有丝分裂各时期图以及分裂期染色体断片、分裂间期微核图。

2、了解化学污染物对生物毒性作用的微核效应利用蚕豆根尖等实验材料进行细胞的微核计数，计算出微核千分率（MCN‰），根据它可准确地显示受试物诱发畸变的效果。

3、学会用微核法评价环境污染状况MCN‰或通过它计算得到的污染指数可用于污染状况、程度的监测和评价。

如果对照本底MCN‰为10‰以下，可采用如下标准进行分析以确定样品的污染程度：MCN‰在10‰以下，表示基本没有污染；MCN‰在10‰－18‰区间，则表示有轻度污染；MCN‰在18‰－30‰区间，则表示有中度污染；MCN‰在30‰以上，则表示有重度污染。

也可以采用“污染指数”判别：此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN‰本底的波动，方法如下：污染指数在0－1.5区间为基本没有污染；污染指数在1.5－2区间为轻度污染；污染指数在2－3.5区间为中度污染；污染指数在3.5以上为重度污染。

药物毒理学实验指导南方医科大学药学院实验中心二0一0年八月目录实验一、药物急性毒性实验（LD50测定）实验二、急性肺损伤实验实验三、药物免疫毒性试验实验四、小鼠骨髓细胞微核试验实验五、小鼠精子畸形实验实验六、药物生殖毒性实验实验一 急性毒性试验［盐酸二甲弗林（回苏灵）LD 50测定］一、实验目的化学物急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。

本实验的目的是学习急性毒性试验的实验设计、实验原理和实验操作方法。

二、基本原理选择健康的实验动物，根据体重按随机分组的方法，依据LD 50计算的设计原料则将动物分成数个染毒组。

一次或24h 内多次给予受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的情况等，根据各组动物死亡数计算半数致死量（LD 50）。

据此分析受试物毒性反应与剂量的关系，并根据LD 50值对化学物进行毒性分级。

三、实验材料1、器材 1ml 注射器、烧杯、电子天平、苦味酸、镊子、剪刀、酒精棉球等。

2、药品 0.4％回苏灵注射液（经预试验后按比例稀释）。

3、动物 健康成年小白鼠若干只，体重18-22g ，雌雄各半。

四、实验方法 1、预试验（1）探索剂量范围：先找出100%与0%的致死量为实验的上下限剂量，即Dmax 和Dmin 。

取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax ；如降低一剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax 。

同法找出Dmin 。

（2）确定合适的剂量分组方案：组数（n ）以5-8组为宜，根据下面公式计算组间剂量公比r 。

r=1/1min max/ n D D各组剂量分别Dmax 、(Dmax) r 、(Dmax)r2、(Dmax)r3……。

2、正式试验（1）动物的称重、编号和分组： 每组10只动物（雌雄各半），随机分组和用苦味酸编号。

蚕豆根尖微核实验（诱导与检测部分）一、实验目的1、了解环境诱变物对微核产生的原理。

2、掌握微核试验技术。

3、了解毒理遗传学在环境监测中的应用及意义二、实验原理微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期由于不能向两极移动而游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，可在它附近看到若干个圆形的结构，直径大约是细胞直径的1/20到1/5，这就是微核。

微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。

在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核1/3以下。

微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。

一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。

这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。

已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。

所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。

由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏、技术简单的测试系统来监视环境的变化。

只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。

且有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率可达99%以上。

目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。

利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。

微核产生的概率可与诱变因子的剂量成正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。

三、实验器具、药品1、实验材料蚕豆种子2、实验器材光学显微镜、试管（10ml）、蚕豆发芽盒、镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等。

3、试剂1）NaN3(叠氮钠)2）卡诺氏固定液（乙醇和冰醋酸按照体积比3：1混合配制）4）6mol/L盐酸：配制：取49.5ml 37.5%的盐酸，再加入50.5ml水稀释至100ml容量瓶.四、实验步骤1、种子处理：蚕豆种子洗涤干净，室温（25℃）下用蒸馏水浸泡发芽24小时，此间至少换水两次，所换水应预温至25℃。

毒理学实验技术总结毒理学作为一门研究外源性化学物质对生物体产生有害作用的学科，其实验技术的发展对于评估化学物质的安全性和风险至关重要。

以下是对常见毒理学实验技术的总结。

一、急性毒性实验急性毒性实验是评估化学物质在短时间内（通常 24 小时至 2 周）对生物体造成的毒性效应。

实验动物通常选用小鼠或大鼠，通过不同的给药途径（如经口、经皮、吸入等）给予一定剂量的受试物。

观察指标包括动物的死亡情况、临床症状（如行为异常、呼吸困难等）、体重变化等。

根据实验结果，可以计算出半数致死剂量（LD50）或半数致死浓度（LC50），这是衡量化学物质急性毒性的重要指标。

二、亚急性和亚慢性毒性实验亚急性毒性实验的时间通常为 28 天至 90 天，亚慢性毒性实验则为90 天至 180 天。

这些实验旨在观察化学物质在较长时间内低剂量暴露下对生物体的潜在毒性。

除了观察一般症状和体重变化外，还会检测血液生化指标（如肝功能、肾功能指标）、组织病理学变化（如肝脏、肾脏、心脏等器官的组织形态改变）等。

三、慢性毒性实验慢性毒性实验的周期较长，一般为 1 年以上，甚至可能持续动物的整个生命周期。

这种实验更能反映化学物质长期暴露对生物体的影响，包括致癌性、致畸性、致突变性等。

检测指标与亚急性和亚慢性毒性实验类似，但更加注重对肿瘤发生、生殖系统影响以及遗传物质损伤的评估。

四、遗传毒性实验遗传毒性实验用于检测化学物质对生物体遗传物质（DNA）的损伤作用。

常见的方法包括：1、细菌回复突变试验（Ames 试验）：通过观察受试物是否能引起细菌基因突变来评估其遗传毒性。

2、染色体畸变试验：观察细胞染色体结构和数量的变化。

3、微核试验：检测细胞中微核的形成，反映染色体的损伤。

五、生殖毒性实验生殖毒性实验主要研究化学物质对生殖系统的影响，包括对生殖器官、生殖细胞、胚胎发育等方面的作用。

实验分为三段：1、Ⅰ段：生育力与早期胚胎发育毒性实验，评估对雌雄动物生殖能力和早期胚胎发育的影响。

小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。

故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。

实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。

（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。

（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。

同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。

混匀后推片。

长度为2-3cm。

3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。

4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。

5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。

实验三小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法。

二、实验原理微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。

微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20～1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。

一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。

所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。

微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。

由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中的微核。

三、器材与试剂1、器材手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片染、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、2ml注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。

2、试剂－甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液（取Giemsa染料lg，甘油66m1，甲醇60ml。

先将染料置于研钵内，加入少量甘油混合研细，再分次倾人剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置60oC水浴2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。

该储备液存放的时，间越长，染色效果越好。

临用时用pH6.8的磷酸盐缓冲液配制为10％的应用液）、pH6.8的磷酸盐缓冲液。

（1）1/15mol/L磷酸二氢钾（KH2PO4）溶液：称取分析纯KH2PO49.06g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

（2）1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液：称取分析纯Na2HPO49.45g/kg或Na2HPO42H2011.87g;Na2HPO47H2017.87g;Na2HPO412H2023.88g）用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

一、意义和目的•学习小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法，了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。

二、原理•基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性,是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。

还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变,染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。

因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic endpoint )。

• 国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类:①DNA完整性的改变(形成加合物、断裂、交联)；②DNA重排或交换；③DNA碱基序列改变；④染色体完整性改变；⑤染色体分离改变。

其中③实际上指基因突变；④指染色体畸变。

•微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。

微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，其染色与细胞核一致，大小相当于细胞直径的l／20～l ／5，呈圆形或杏仁状，在间期细胞中可以出现一个或多个。

• 一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质(染色体断片或迟滞的染色体)。

所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点，用于检测断裂剂及非整倍体诱发剂。

微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别，故常计数PCE细胞中的微核，因为当成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞（NCE），并进入外周血。

在主核排出时，但微核仍保留于PCE细胞中。

操作步骤• 动物选择首选物种是小鼠和大鼠。

以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7～12周龄。

每组小鼠数量10只，雌雄各半。

无首选品系，通常用实验室品系。

• 染毒途径根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。

微核试验法－检测环境污染微核(micronuclei)简称(MCN)是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。

微核是在间期细胞时能观察到的染色体畸变后遗留产物。

微核试验(Micronuclei Test) 是一种快速、简便检测环境诱变物的方法。

可用来检测水体环境诱变物，为环境监测提供细胞学方面的依据。

在细胞间期可见微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。

微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。

一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的。

实验证实，整条的染色体也能形成微核。

这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。

已经证实，在一定范围内，微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。

现有的微核测试系统多数是用哺乳动物的骨髓细胞或外周血细胞。

缺点是需要一定培养条件与时间、细胞同步化困难、微核率低，一般只在0.2％左右。

[实验方法及步骤]重金属镉离子(cd2+)诱导黄鳝外周血细胞微核实验方法。

1．实验用水准备实验用水，可用曝气数天的自来水。

2．实验用容器可用实验室内的水槽，清洗后，加入定量曝气的自来水。

3．试剂诱导配实验用试剂CdCl2·2.5H2O，设20mg/L、2mg/L、0.2mg/L、0.02mg/L四个培养终浓度梯度。

把规格一致的黄鳝放入含试剂的溶液中七天，期间可换水重新补充试剂。

另设同样条件的空白对照，可用曝气的自来水作为对照饲养。

4．断尾取血，做血涂片取黄鳝，断尾后，取出外周血，滴于载玻片上，做均匀涂片。

注意掌握动作要领，涂片均匀。

涂片空气干燥。

5．外周血涂片固定把干燥后的涂片，插入染色缸的插槽中固定10分钟后取出，气干。

6．Giemsa染色固定后的涂片，采用骨髓染色体制备的染色体扣染法，染色15分钟后，取出载片。

在小水流下冲片，小心擦干玻片，注意不要碰到细胞面。