动物细胞培养(通用)

合成培养基

液体 干粉
血清



FBS FCS 新生牛血清 人自体 AB 灭活：560c，30min
细胞计数

计数板： 充分混匀,
计上不计下， 计左不计右， 每个象限不少于50个细胞， 多次计数取平均值。
细胞的运输

细胞株:
最好370C, 瓶内留有空气, 防震防压, 时间尽量短

空气 器材 操作 血清 组织样本
细胞污染的影响

培养基浑浊 细胞生长缓慢 细胞活性较低 细胞病变或死亡
污染细胞抢救



抗生素:5-10倍常用量 霉菌:25ug/ml制霉菌素 或 10ug/ml 酮 康唑 加温 支原体: 410C ,5-10h 动物体内接种
污染细胞抢救
细胞传代


消化液：胰蛋白酶（含或不含EDTA）， 吹打 传代比例:视生长情况，防止细胞生长过 密
细胞冻存和复苏

冻存液：DMSO 冻存条件：-80；液氮 原则：缓冻速溶
细胞生长条件


无污染 无毒 营养: 细胞培养的培养基必须供给活细胞所需要的全 部盐类、氨基酸、脂肪、糖类、维生素,生长因子等。 温度:35-37 0c 渗透压:人:290mmol/L Ph: 7.2～7.4 CO2:5%
合成培养基

合成培养基: 根据细胞生长的需要按一定配方制成的 粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生 素、碳水化合物、无机离子和其他辅助 物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细 胞外液相似。
合成培养基

合成培养基（化学成分清楚） 合成培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基， 组分稳定，可大量供应。合成培养基发展至今已有几 十种，大部分已商品化。由于细胞种类和培养条件不 同，适宜的合成培养基也不同，在动物细胞培养中最 常用培养基7－8种，如BME、MEM、DMEM、IMEM、 HAM F12、PRMI1640、M199等。 由于天然培养基的一些成分仍然不清楚，不能用 已知的化学成分代替，因此必需在合成培养基中添加5 ％~10％的小牛血清。在杂交瘤培养中，要求更严格， 添加浓度更高，一般为10％～20％的胎牛血清。血清 的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和 检测会组成一定的不便。
动物细胞培养相Biblioteka Baidu知识
哺乳细胞种类


原代培养： 传代培养：细胞系和细胞株 细胞系（cell line） ：初代培养物开始第 一次传代培养后的细胞 细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克 隆形成法从原代培养物或细胞系中获得 具有特殊性质或标志物的培养物称为细 胞株
细胞种类


贴壁细胞：贴壁,伸展,接触抑制,密度限 制 悬浮细胞: 血液白细胞



抗生素:5-10倍常用量 霉菌:25ug/ml制霉菌素 或 10ug/ml 酮 康唑 加温 支原体: 410C ,5-10h 动物体内接种
细胞污染处理

细菌：细菌污染后，培养基1-2 天就会 变色，应迅速将污染细胞与其它细胞系 隔离，灭菌后丢弃， 还要用实验室消毒 剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA 过 滤器。
细胞污染处理

病毒：由于病毒寄生生存，爆发后尽快 和正常细胞隔离，灭菌后丢弃处理，相 对来说容易处理，但是对操作者威胁较 大。
细胞污染处理

真菌（霉菌和酵母菌）：目前没有好的 抑制方法，包括现在常用的两性霉素， 一旦污染容易反复爆发，因为孢子很难 杀灭。
细胞污染处理

支原体：支原体污染后，因为它们不会 使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养 基一般不发生浑浊，细胞无明显变化， 外观上给人以正常感觉，实则细胞已经 受到多方面潜在影响，如引起细胞变形， 影响DNA合成，抑制细胞生长等。污染 细胞应灭菌后丢弃处理.
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四、培养基的分类

无血清培养基 无血清培养基（serum free medium, SFM）是全部用已知成分组 配的不加血清的合成培养基，通常在含有细胞所需营养和贴壁因 子的基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子，保证细胞良好生 长，是最适合于制药生产的培养基。它提高了培养的质量，避免 了使用血清带来的麻烦：血清中某些细胞毒性成分，血清中存在 病毒、真菌、支原体等微生物污染的危险，血清中蛋白对产物蛋 白测定的干扰。产品纯化容易，组分稳定，可大量配制。已有各 种无血清培养基上市。 一些合成培养液可以作为无血清培养液的基础，如CMRL 1060、TC199、IMDM、McCoy 5a、Ham’s F10和F12。已有其他 商品化的无血清培养液，如淋巴细胞无血清培养基、内皮细胞无 血清培养基、杂交瘤细胞无血清培养基、巨噬细胞无血清培养基 等。 无血清培养基通常添加生长附加成分，如激素与生长因子、 低分子营养成分和转铁蛋白等，主要包括胰岛素、孕酮、硒酸钠、 腐胺、转铁蛋白。对于大规模生产用的无血清培养基，往往成分 不完全清楚，但简单而且低成本。

其他:
密封, 防止上冻, 时间尽量短
细胞污染及处理


微生物: 细菌、真菌（霉菌和酵母菌）、 病毒、 支原体 化学物质 细胞交叉污染
细胞状态观测与检测



时刻观察细胞形态,密度 观察培养基颜色，透明度 培养温度，CO2浓度 无菌检测 病毒检测 内毒素检测 支原体检测
细胞污染途径
培养瓶的选择

透气盖 不透气盖 瓶底包被的基质 吹打时避免碰到瓶底细胞生长一侧
培养基

天然培养基 合成培养基 无血清培养基
天然培养基

天然培养基（小牛血清、胚胎液）: 是最早期人们采用的细胞培养基，直接取自于动物组 织提取液或体液作为培养基，如血浆凝块、血清、淋 巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，但成分复杂，而 且不稳定，来源也受到限制，不宜大量培养和生产使 用。水解乳蛋白和胶原是两种较好的天然培养基，富 含氨基酸。 血清是天然培养基中最有效和最常用的培养基，有些 成分功能明确，另外一些成分功能不明确。血清的来 源有胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、 羊血清及人血清，最广泛应用的为胎牛血清和新生牛 血清。血清和水解酪蛋白应用于许多细胞系和原代及 传代细胞培养。