基因工程抗体及其发展前景.ppt

抗体技术的挑战
抗体生产成本高
01
由于抗体的大规模生产需要大量的细胞培养和纯化过程，因此
生产成本较高，限制了抗体的广泛应用。
抗体特异性问题
02
抗体的特异性是影响其应用的关键因素之一，如何提高抗体的
特异性是当前面临的重要挑战。
抗体稳定性不足
03
一些抗体在存储和运输过程中容易失去活性，影响其应用效果。
抗体技术的发展前景
生物制药
药物研发
抗体作为药物载体，可以用于药 物的定向输送，提高药物的疗效
和降低副作用。
免疫检测试剂
抗体可以用于制备免疫检测试剂， 如酶联免疫吸附试验（ELISA）、 免疫荧光等，用于检测生物体内
的物质。
单克隆抗体药物
利用杂交瘤技术制备的单克隆抗 体药物，具有高度特异性、低毒 性和长效性等特点，已广泛应用 于肿瘤、自身免疫性疾病等领域。
应用生物化学-抗体技术PPT 课件
• 引言 • 抗体的产生与种类 • 抗体技术的原理与流程 • 抗体技术的应用实例 • 抗体技术的挑战与前景 • 结论
01
引言
抗体的定义与特性
抗体
指免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异识别并结合抗原，发挥 免疫效应。
特性
高度特异性、结合力强、种类多 样。
抗体技术的历史与发展
历史
自19世纪末发现抗体以来，抗体技 术不断发展，经历了免疫学、单克隆 抗体技术、基因工程抗体等阶段。
发展
目前抗体技术已广泛应用于生物医药 、诊断、治疗等领域，为人类健康和 疾病治疗做出了巨大贡献。
抗体技术的应用领域
01
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生物医药
用于药物研发、疾病诊断 和治疗，如肿瘤免疫治疗、 自身免疫性疾病治疗等。

在嵌合抗体的基础上进一步将 鼠 MAb 可 变 区 中 相 对 保 守 的 FR(framework region)替换成人的FR， 保留与抗原结合部位决定簇互补区 （complement determinant region) 部位 (即CDR移植)
早期的改型抗体：
简单的CDR移植，通过点突变进行微 调即更换某个位点上的氨基酸。
理想的抗体药物的性质
高特异性和高亲和力（Kd=108~1010L/M） 对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排 斥反应 游离抗体不激活补体 一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能 细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养 抗体符合生物制品标准
抗体治疗存在的问题及对策
问题
对策
异源蛋白导致产生抗抗体，• 抗体人源化 影响靶向性和效果
2 开创人类抗体基因组学的研究 评 价：1 诺贝尔奖得主Dr Milstein 推荐发表在
PNAS 2 世界权威杂志“科学”发表了新闻评述 3 剑桥大学开了新闻发布会
未来单抗开发的完美方案
从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体 全人抗体挑战靶分子的筛选 开发未知抗原的治疗用抗体
已批准上市的单抗
适用病症 移植排斥 大肠癌 冠心病
AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白 质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列 中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构 象和免疫原性的新型抗体。
今后抗体药物发展的方向
寻找新的靶抗原 基于抗原立体结构设计抗体 基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗 体模拟物
最理想的单克隆抗体 100%人源 人类免疫系统自然产生
功能：具有较好的抗原结合能 力，且分子量小、穿透力强、免 疫原性低等特性。可与其他效应 分子构建成多种具有新功能的抗 体分子，是构建免疫毒素和双特 异抗体等的理想而基本的元件 。

基因抗体：通过基因工程手段， 基因抗体：通过基因工程手段，保留抗体重轻链可变区中主要 与抗原结合的CDR功能区 而形成的各种功能抗体． 功能区, 与抗原结合的 功能区 而形成的各种功能抗体．
Complementary-determining regions: CDR
基因工程抗体的分类
基因工程抗体的分类
第二节： 第二节： 基因工程抗体制备的主要方法：
1.人鼠嵌合抗体 人鼠嵌合抗体 （Chimeric Antibodies） ）
• 原理：利用基因重组技术，把鼠抗体的 重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定 区的进行重组，减少鼠源结构，增加人 源结构，而保持抗体与原抗原的特异性 结合。 • 缺点：
鼠抗体部分亦能作为一种异种抗原，多次反 复使用在人体产生抗体及过敏反应（HAMS 反应，human against mouse syndrome)。 嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原降 低，但亲和力明显下降。
全人抗体
Fully Human
100% human protein High
Potential for Immunogenicity
Low
Lonberg N. Nat Biotechnol. 2005;23:1117-1125. Ternant D, et al. Expert Opin Biol Ther. 2005;5(Suppl 1):S37-S47. . Yang X-D, et al. Crit Rev Oncol Hematol. 2001;38:17-23. Weiner LM. J Immunother. 2006;29:1-9.
马血清,破伤风,狂犬病
基因工程抗体
鼠源抗体的人源化 及形式多样的改造抗体

肿瘤的体内显像诊断 病毒的诊断和抗病毒感染 血液性疾病的诊断
cover illustration Antibody single-chain fragment stability-engineered by point mutations (A) and by a CDR-graft to the most stable human consensus framework (B). Insufficient thermodynamic stability can limit the use of particular antibody fragments as targeting moieties in therapeutic constructs, such as e.g. immunotoxins or immunoliposomes. This limitation can be overcome by a graft of the antigen combining site to a more stable antibody framework. However, such grafts sometimes fail to reach the superior stability of the acceptor framework. Comparison with the stabilization obtained with a set of designed point mutations shows that this is not always due to destabilizing interactions within the complementary determining regions, but to subtle structural differences between different classes of antibody frameworks that introduce strain in CDR grafts to divergent frameworks. For further details please see Kügler et al. (pp.135–148) and Honegger et al. (pp. 121–134).

（三）单链抗体（single-chain antibody
） • 又称FV分子。
• 目的：基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段，即FV分子或单链抗体 蛋白。
• 本质：是由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。此外肽 连接物还可将药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。
优点
• 这类抗体具有分子量小，作为外源性蛋白的免疫原性较低；在血清中比完整的单 克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清除；无Fc片段，体内应用时可避免非特异性 杀伤；能进入实体瘤周围的微循理：可将抗体分子的部分片段（如V区或C区）连接到与抗体无关的序列上（如 毒素），就可创造出一些Ig相关分子
• 催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在 的高效催化剂，对生物学、化学和医药等多种学科有重要的理论意义和实用价值。
（二）催化抗体的制备
• 催化抗体（抗体酶）技术是化学和免疫生物学的研究成果在分子水平交叉渗透的产物 ，是将抗体的极其多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的蛋白质分子设计的新 方法，故而显示出较高的理论和实用价值，成为酶工程领域中的研究热点。
2. 导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链 3. 再将小鼠杂交瘤细胞的Ig VL基因与人的CL基因相连 4. 转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞 5. 筛选分泌鼠－人嵌合抗体的骨髓瘤细胞
所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分 泌的抗体特异性和亲和力相同，但减 少了抗体中的鼠源性成分
（二）重构抗体（reshaping anti body）
基因工程抗体
（genetic engineering antibody）
• 随着DNA重组技术以及其它分子生物学技术的发展，人们利用基因工程技术来制备抗体 分子，这种抗体分子称为基因工程抗体，这是分子水平的抗体。

第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片 段与毒素的A链或与A链相似的单链核 糖体失活蛋白的结合物。因避免了第 一代免疫毒素的非特异性，故能在体 内有一定的抗肿瘤作用。
第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因 克隆方法改造毒素基因和小分子抗体 基因重组表达。特异性好、稳定性强、 渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。
3.间 质 性 肺 炎 以肺间 质炎症 为主， 病变累 及支气 管壁及 其周围 组织， 有肺泡 壁增生 及间质 水肿。 可由细 菌、支 原体、 衣原体 、病毒 或卡氏 肺囊虫 等引起 。 病因 学分类 1.细 菌 性 肺 炎 如肺炎 链球菌 （即肺 炎球菌 ）、金 黄色葡 萄球菌 、甲型 溶血性 链球菌 、肺炎 克雷白 杆菌、 流感嗜 血杆菌 、铜绿 假单胞 菌、埃 希大肠 杆菌、 绿脓杆 菌等。 2.非 典 型 病 原 体所致 的肺炎 如军团 菌、支 原体和 衣原体 等。
③小分子抗体易到达肿瘤部位， 可显著提高N/NT值。
④抗体在肿瘤部位可保留6～9日 ⑤能观擦抗体在血中的半衰期和
可能出现的不良反应。
放射免疫显像定位技术
将抗肿瘤单克隆抗体（Ab）与二乙基 三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成 Ab-DTPA，再注入体内后，就能与体 内组织相结合。由于抗体分子量大， 需3天完成。3天后注入放射性核素In113M（半衰期100m），因DTPA是重 金属离子络合剂，所以In-113M可以结 合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。 这一过程在2小时内可完成。
④测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗 原的酶标抗体诊断试剂
⑤甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊 断试剂
⑥癌胚抗原（CEA）的酶标抗体 诊断试剂
⒊放射免疫用抗体诊断试剂
放射免疫技术是将放射性核素 分析的高度灵敏性与抗原抗体 反应的特异性结合起来建立的 检测技术。

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该技术的普及使得众多科学家通过细胞工程可以 在体外定向地制备各种单克隆抗体(mono—clonal antibody，McAb)。
由于McAb特异性强，性质均—，易于大量生产， 在生命科学研究及医学实践方面作出了杰出的贡 献，并形成产业，成为生物技术的重要支柱之—。
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原理
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基因工程抗体技术
研 究上： 以免疫转印法检测 特定抗原 检 验上: 以 ELISA 侦测特定 病原体 医 疗上: 以毒素连结抗体攻击 病变細胞
3
抗体的发现
1888年Emile Roux及 A1exander Yersin 由白喉杆菌的培养 上清中分离到可溶 性毒素，后者注入 动物体内可引起典 型的白喉发病症状。
9
1968年和1972年,世界 卫生组织和国际免疫学 会联合会所属专门委员 会先后决定，将具有抗 体活性或化学结构与抗 体相似的球蛋白统称为 免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)
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抗体生成的两个阶段
在未受抗原刺激之前: 机体所具有的多 样性抗体生成细胞群体可看作一个初级 库(repertoire)，其所包含的信息是由亿 万年进化及遗传决定的。
80年代，尝试以基因工程方法改造鼠源性McAb--McAb的“人源化”(humanized antibody)：将小 鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生 人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗 体。
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嵌合抗体
从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig 恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主 细胞，表达人-鼠嵌合抗体v。 特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性; 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
于是认识到毒素及细菌之外的众多蛋白质均可诱 导相应抗体的生成，是一种广义的免疫现象。

构建重组表达载体
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2 鼠单抗可变区的人源化
尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时 它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗 体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。
CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的 可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗 体，也就是人源化抗体。
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经过CDR移植，抗体的免疫原性很低， 而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原 及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改 形抗体都已有报道，到现在已有数百种人 源化抗体。
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由于人杂交瘤-单抗体系的低效性，使人 单抗的制备一直进展缓慢。抗体库技术为人 单抗的制备提供了有效的手段。对于能获得 体内免疫的抗原，从被免疫者获取淋巴细胞
体。
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随着抗体库技术的成熟，大容量抗体库 的构建，已能够不经免疫从总抗体库筛选 出高亲和力的人源抗体。
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治疗型单克隆体－基因时代明星
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第二节 鼠单抗的人源化 1.人鼠嵌合抗体：
鼠单抗的可变区序列＋人抗体恒定区序列 2.利用计算机辅助设计，通过定点突变，改变
可变区的氨基酸，减少鼠源性。
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1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies)
人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒 定区融合而得到的抗体。
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构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可 变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因 及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择 标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤 细胞、CHO细胞)中表达。
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HAMA反应的示意图
影响单抗与靶细胞或抗原结合 引起变态反应和器官损害
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基因工程抗体