核酸检测的步骤
1、要分清是发热病人还是普通病人，也就是说如果是有发热或者是有流行病学史、接触史的患者要到指定医院发热门诊指定的取核酸地方，因为这样是为了避免交叉感染。如果是普通群众复工、复产、复学做的核酸检测，应当在另外一处。
2、在核酸检测之前必须要实名登记，也就是说要把真实姓名、地址、
身份证信息如实登记。
3、做核酸之前要保持口腔清洁，然后在等待做核酸的期间要佩戴好口罩，自觉保持1m以上的安全距离。在取核酸的时候需要注意最好是能忍住不要咳嗽，以免飞沫喷出。在取核酸的时候医生会要患者张开嘴巴，用一根像棉签一样的试纸去擦拭咽部以及扁桃体，或者是鼻腔周围的分泌物。等采集到分泌物以后就会放置专门的采集收样袋，在低温下保存送检。核酸检测结果的检出时间，因地区采集量以及检
测量而不同。
核酸检测基本知识 1.什么是核酸检测 核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。 核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息 和传递遗传信息。 2.核酸的分类 核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 3.核酸的组成
DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P，5种元素组成。DNA是绝大多数生物的遗传物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人的DNA却是很长的，约有3X10^9个核苷酸。 4.核酸的功能 在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的 作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物 合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列 重大生命现象中起决定性的作用。 DNA与RNA都是核酸，它们在化学组成上有什么区别如 下： DNA与RNA的比较DNA RNA 主要存在部位细胞核细胞质 基本组成单位脱氧核苷酸核糖核苷酸碱基种类A、G、C、T A、G、C、U 五碳糖种类脱氧核糖核糖 核苷酸链两条脱氧核苷酸链一条核糖核苷酸链 5.检测方法 核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检 测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生
物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核 酸检测。 目前主要使用的方法有以下几种： a.核酸序列依赖性扩增法 NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性 核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。 整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA 杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火,在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量 扩增。 b.转录介导的扩增技术 TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。 c.连接酶酶促链式反应(LCR) LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种
XXXX医院 新冠核酸检测操作流程 一、个人三级防护穿戴 带一次性帽子、佩戴医用N95口罩、一次性防护服、一次性鞋套、一次性防水靴套、一层乳胶手套、外层一次性隔离衣、防护目镜、第二层乳胶手套、穿戴完毕后应尽快通过专用缓冲间或者走廊，进入核酸提取区（专业核酸提取实验室）。 相关防护用品：护目镜、口罩、手套、防护服 二、样本灭活处理 新冠核酸检测须有两名工作人员快速通过进入实验室，进行灭活实验操作。生物安全柜内需配备吸水棉与消毒酒精、有条件可配备吸水台布，对样本溢洒时进行紧急处理；打开二级容器，用75%酒精消毒物体表面，检测样本管密闭性后进行灭活处理，灭活条件（56℃，30min，水浴等多种方式），取出酒精灭活管用酒精擦拭外表，将样本放入到生物安全柜内。 三、手工核酸提取 操作人员进入试剂配置区或者单独的洁净实验室。 （一）试剂区准备
根据说明说要求，在AW1中加入无水乙醇130mL，在AW2中加入无水乙醇160mL，计入无水乙醇后及时做好标记，在310μg的Carrier RNA中加入310μL AVE，并颠倒混匀使Carrier RNA充分溶解，就此完成洗液AW1、洗液AW2和Carrier RNA配置，而后通过传递窗传送到样本处理区，或者由专人送到核酸提取实验室中。 （二）样本的裂解 用1.5ml的无菌EP管，移液器移取560μl AVL裂解液，加入5.6μl Carrier RNA，加入140μl的已灭活的待提取核酸的待测样本，涡旋振荡15s，室温静止10min。将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物，防止污染。裂解完成后，加入560μl无水乙醇，振荡混匀15s，将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物，防止污染。 向离心柱加入裂解产物630μl，8000转离心1min，若离心机在生物安全柜之外，每次使用都需进行外表面消毒。更换新废液收集管，要从离心机中小心取出离心柱，将上层离心柱转移到新收集管中，继续将剩余裂解产物630μl加入离心柱中，若样本体积大于140μl时需重复此步骤，直到全部裂解产物都过柱离心，8000转离心1min，小心将离心柱转移到新的收集管中。 取500μl AW1加入离心柱中（注意，此处加样操作时务必将移液器吸头接触离心柱内壁缓慢加样），8000转离心1min。小心取出离心柱，更换新的收集管。
新冠病毒核酸检测培训测试 单选题:1. 根据目前掌握的新型冠状病毒生物学特点、流行病学特征、致病性、临床表现等信息，该病原体暂按照病原微生物危害程度分类中（）类病原微生物进行管理？ A. 第一 B. 第二 C. 第三 D. 第四 单选题:2. 可以进行新型冠状病毒检测标本采集人员为? A. 经过生物安全培训，培训合格且具备采样技能的人员 B. 医生 C. 研究所科研人员 D. 实验室管理人员 单选题:3. 新型冠状病毒检测标本首选? A. 呼吸道标本 B. 便标本 C. 尿液 D. 结膜拭子标本 单选题:4. 新型冠状病毒感染的特异性检测不包括? A. 核酸检测 B. 病毒分离 C. 抗体检测 D. 生化检测 单选题:5. 抗体检测最好选用? A. 发病早期血清 B. 空腹血 C. 恢复期血清 D. 发病早期、恢复期双份血清 单选题:6. 新型冠状病毒核酸检测技术不包括? A. 高通量测序 B. 荧光RT-PCR C. 数字PCR技术 D. 病毒分离 单选题:7. 以下哪个条件不能确认新型冠状病毒感染? D
A. 同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性 B. 两种标本实时荧光RT-PCR检测同时出现单靶标（ORF1ab或N）阳性 C. 同种类型标本两次采样检测重复出现单个靶标阳性（ORF1ab或N） D. 单种标本单次单靶标阳性（ORF1ab或N） 单选题:8. 可在BSL-2级实验室开展的新型冠状病毒相关实验活动不包括? A. 病毒分离 B. 标本分装 C. 标本灭活 D. 核酸检测 单选题:9. 新型冠状病毒感染动物实验可以在（）实验室开展? A. BSL-1 B. BSL-2 C. BSL-3 D. ABSL-3 单选题:10. 鼻拭子采集的关键点是什么？ A. 鼻拭子：待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转一周 B. 鼻拭子：沿下鼻道的底部向后缓慢深入，待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转三周 C. 鼻拭子：沿上鼻道的底部向后缓慢深入，待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时即可 D. 鼻拭子：沿中鼻道的底部向后缓慢深入，待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转三周 单选题:11. 咽拭子采集部位的关键点是什么？ A. 咽拭子：两侧咽扁桃体和咽后壁上下擦拭至少30秒 B. 咽拭子：两侧咽扁桃体稍微用力来回转动擦拭，然后在咽后壁上下擦拭至少30秒 C. 咽拭子：两侧咽扁桃体稍微用力擦拭，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次 D. 咽拭子：两侧咽扁桃体来回转动擦拭，然后再在咽后壁上下擦拭至少1次 单选题:12. 实验室戴手套的注意事项？ A. 两层普通手套 B. 两层能盖过袖口的手套，每次戴手套前要做充气检查 C. 长袖筒一次性医用橡胶手套两层，手套袖筒必须覆盖住防护服袖口，用充气方法检查手套是否破损 D. 两层手套，用充气方法检查手套是否破损 单选题:13. 采集新冠病毒呼吸道标本时戴什么级别的口罩？ A. N95及以上口罩 B. N99口罩 C. 医用外科口罩
编号：2-9 主题：digital PCR 概述： Digital PCR（dPCR)即数字PCR，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可以直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。由于数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，因此特别适用于依靠Real-time PCR的Ct值不能很好分辨的应用领域，例如：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。目的： 对DNA分子的个数进行绝对定量。 原理： 其主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。 步骤： 1.分离并纯化基因组DNA； 2.计划数字PCR实验，确定样品的最佳稀释度，以获得数字PCR答案；
3.上样，将DNA样品与TaqMan Assay以及OpenArray数字PCR预混液上样到OpenArray 384孔板； 4.循环和成像，利用OpenArray AccuFill 系统将反应上样到OpenArray平板。将OpenArray平板插入OpenArray箱中，装满浸液，并用封箱胶水密封。利用OpenArray? 实时定量PCR系统开展读取。 5.快速轻松地获取和分析数据。 流程图：
达安基因新冠核酸快速检测 ——万人通量检测整体解决方案当前疫情在全球蔓延，国内零星散发病例和局部暴发疫情的风险仍然存在，秋冬季新冠肺炎和流感等呼吸道疾病交织叠加，防控任务艰巨。 应疫情防控需要，面对庞大的检测人群压力以及巨大的卫生经济资源压力，寻求一种有效的解决途径势在必行。在2020年8月27日，国务院联防联控机制印发《进一步推进新冠核酸快速检测能力建设工作方案》，提出了推进新冠核酸快速检测能力建设的新要求，也提出了新冠核酸快速检测的要求，混合样本检测是实现检测能力增长的关键之一！ 面对新冠核酸快速检测能力建设的新要求，达安基因特推出“万人通量检测整体解决方案”的新冠核酸快速检测方案，该新冠核酸快速检测方案以日检测量1万例进行搭配、可适应混样提取、减少设备投入、大幅度降低检测成本、节约人力和时间，在较短时间内完成庞大人群的核酸检测。此新冠核酸快速检测方案特点如下： 1、检测时间快 达安基因新研发的新冠核酸快速检测产品——新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒相比于市场的常规检测试剂，更快速完成新冠核酸检测，使用快速逆转录酶和热启动酶，逆转录时间由常规的15-30 min缩短至2min，热启动时间由常规10-15 min缩短至2 min，PCR延伸时间由常规的每循环30-60 s缩短至10 s，全程高效扩增。 2、搭配灵活 新冠核酸快速检测1万份/天混采——10合1方案
新冠核酸快速检测1万份/天混采——5合1方案 3、投入少，空间利用率高：搭配新冠核酸快速检测试剂，大幅提高检测通量，可降低检测仪器数量； 4、成本低，检测效率高：在8 h内就可达到1万人份的样本新冠核酸快速检测能力，可充分缓解目前因检测能力不足而带来的压力。 达安基因在核酸混检的新冠核酸快速检测方案中充分考虑了检测平台空间、工作时间、检测效率等指标，可在设备、人力和时间有限的情况下快速进行大量样本检测。 5、复查极速 新冠核酸快速检测混检阳性检测——复查方案
1.新型冠状病毒感染的重症病例优先采集： A:上呼吸道标本 B:下呼吸道标本 C:尿标本 D:全血标本 E:血清标本 2.新型冠状病毒采集的血液标本应尽量釆集发病后（）内的急性期抗凝血： A:3天 B:5天 C:7天 D:10天 E:14天 3.新型冠状病毒感染用于病毒分离和核酸检测的标本24小时内无法检测的标本则应置于（）或以下保存： A:-30℃ B:-40℃ C:-50℃ D:-60℃ E:-70℃ 4.新型冠状病毒血清标本可在4℃存放： A:3天 B:5天 C:7天
D:10天 E:14天 5.新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于：A:A类 B:B类 C:C类 D:D类 E:E类 1.新型冠状病毒属于 A:α属 B:β属 C:γ属 D:δ属 E:以上都不是 2.下列哪种消毒剂不能有效灭活病毒 A:乙醚 B:75%乙醇 C:氯己定 D:过氧乙酸 E:氯仿 3.关于新型冠状病毒标本的包装，下列说法正确的是 A:标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装
B:所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧C:容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期 D:将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本 E:以上都正确 4.关于新型冠状病毒的标本保存，下列说法不正确的是 A:能在24小时内检测的标本可置于4℃保存 B:24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存 C:血清可在4℃存放3天，-20℃以下可长期保存 D:应设立专库或专柜单独保存标本 E:标本运送期间可反复冻融 5.2019新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装对应的联合国编号为 A:UN2814 B:UN1602 C:UN3373 D:UN9284 E:UN1605 1.设计有缓冲间的实验室是 A:BSL-1实验室 B:普通型BSL-2实验室 C:加强型BSL-2实验室 D:所有级别的实验室
核酸检测和抗体检测 核酸检测和抗体检测 究竟什么是病毒核酸检测？什么是抗体检测？为什么可以用核酸检测结果作为新型冠状病毒肺炎的确诊依据？我们来了解一下这些问题。 病毒核酸检测是什么？ 病毒核酸检测是常见的病毒感染检查方法，并不局限于新型冠状病毒。在埃博拉、流感、禽流感等多种病毒性疾病诊断中，都会应用到病毒核酸检测技术，区别就在于所检测的病毒特异性基因不一样。 核酸检测是实验室确诊的主要方法。可通过实时荧光PCR检测咽拭子、痰液或血液等标本中2019-nCoV核酸阳性，或通过病毒基因测序，如与已知的2019-nCoV高度同源即为病原学阳性。 它既不需要开刀也不需要打针，采集人体分泌物后，进行留样保存，在实验室条件下，利用PCR技术进行检测，进行临床病原学的确诊。 抗体检测是什么？ 血清抗体检测，简称抗体检测。血清检测大多使用三类方法：间接免疫荧光（IIFT）、间接法 ELISA 和胶体金法。 血清抗体检测冠状病毒感染并不能像病毒核酸检测阳性一样作为病毒感染的“金标准”，因为抗体检测的准确性受制于检测方法、灵敏度、特异性、血样制备等因素。 如何判断有没有新冠病毒？ 最直接的方法就是通过分子生物学技术检测出属于新型冠状病毒的RNA，这就像法医找到嫌疑人的DNA一样，是可以帮助我们找到“幕后凶手”的直接证据。目前检测新型冠状病毒核酸的方法主要包括实时荧光RT-PCR（简称为定量PCR）检测和基因测序，而新型冠状病毒核酸检测试剂盒就基于前者，也是最常用的方法。 核酸检测的流程 新型冠状病毒核酸检测样本一般来自咽拭子。检测时，医生会用一个像棉签一样的拭子去擦拭扁桃体和咽隐窝附近的分泌物，也可以通过鼻腔取鼻咽后部的分泌物，然后放到试管里面，再交给检验部门做相应的病毒核酸的检查。因此，咽拭子采样前应提前漱口。 核酸检测需要经过取样、留样、保存、核酸提取、上机检测五个步骤。
核酸检测技术的应用 规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别实行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本实行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling实行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求实行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 其中112394人份采用单人份核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数78例，不合格率为2.8‰.两者不合格 率比较，有显著性差异（P<0.05）。 类，一类为NAT反应性而ELISA无反应性，即为单独NAT不合格结果, 此类不合格的检出即为NAT在血液筛查中所发挥的检测效能。另一类 为NAT反应性ELISA亦为反应性。303616份标本中全血标本和单采血
核酸检测技术的应用 1资料与方法 1.1检测方法及判定规则305912份全血标本和单采血小板标本进行常规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别进行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本进行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling进行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求进行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1单检模式及混检模式下的NAT结果303616人份标本进行核酸检测，其中112394人份采用单人份核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 2.2全血标本和单采血小板标本ELISA检测结果305912份全血标本和单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-
A.精密度、准确 2.基因芯片技术的本质是(单项)该题正确答案: A、核酸分子杂交技术 3.新型冠状病毒肺炎患者行有创机械通气时,正确的方法是(。(单项)该题正确答案: D.小潮气量和低吸气压力 4.合成RNA的原料是:(单功该题正确答案: C、NTP 5.个人防护装置是用于防止人员个体受到生物性、化学性或物理性等()伤害的器材和用品。(单项该题正确答案:A危险因子 6.标记的参与杂交反应的已知核酸序列是(单项该题正确答案 探针 7.级A1型和A2型生物安全柜的通风连接是使用:(单项该题正确答案 A套管“或“伞型罩“连接 8.第三代测序技术的特征(单项该题正确答案 E、单分子测序 9.新冠病毒核酸检测实验室中,不属于净化实验室专用门特点的是:(单项该题正确答案D以上均不是 10.以下对应关系正确的是()(单项)该题正确答案: B.敏感性一一真阳性/真阳性+假阴性)*100% 11.目前的DNA自动化测序技术可以一次性读取的序列长度约(单项) 该题正确答案 D、1000bp 关于分子信标技术的描述,不正确的是(单项该题正确答案 E、分子信标设计简单 13.国内的生物安全实验室一定要按照国务院发布的()进行管理。(单项)该题正确答案: A《病原微生物实验室生物安全管理条例》 14.从鼻咽拭子中提取的检测新型冠状病毒的剩余核酸提取物不可用于哪种病原体诊断(单项该题正确答案 D丙型肝炎病毒 15.退火温度是决定PCR反应特异性的关键因素,通常退火温度为()该题正确答案 减5℃ 16.实验室人员培训的主要内容:0(单项该题正确答案E以上都是 17.下列关于 Taq DNA聚合酶的描述,正确的是(单项该题正确答案 E、在引物的3-OH末端加入脱氧单核苷酸,形成3',5磷酸二酯键 18.下列关于恒温金属浴的使用说法错误的是()(单项该题正确答案 D孔位不足时,可将管放入加热孔中进行热裂解,加热时间不变。 9.脱卸三级防护装备的顺序是:0(单项该题正确答案: A.鞋套→护目镜→外层手套→防护服→帽子→内层手套→口罩 20.下列哪项不是临床分子生物学检验分析前质量控制的内容()(单功该题正确答案 E.进行核酸提取的有效性评价 21.在核酸检测体系中加入内质控,其作用不是监控的是(单项) 该题正确答案
新冠病毒核酸检测技术人员培训 答案 1.新型冠状病毒感染的重症病 例优先采集： A:上呼吸道标本 B：下呼吸道标本 C：尿标本 D：全血标本 E：血清标本 2。新型冠状病毒采集的血液标本应尽量釆集发病后 （）内的急性期抗凝血： Ａ:3天 B：5天 C:7天 Ｄ:1０天 E:14天 3．新型冠状病毒感染用于病毒分离和核酸检测的标本２4小时内无法检测的标本则应置于（）或以下保存： A:－3０℃ B:—４0℃ C:－５0℃ D：—60℃ E：—70℃ ４．新型冠状病毒血清标本可在4℃存放: A：3天
B:５天 C:７天 Ｄ：1０天 E：1４天 5。新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装分类属于： A：A类 B：B类 Ｃ:Ｃ类 D：Ｄ类 Ｅ:E类 1。新型冠状病毒属于 A:α属 B:β属 C:γ属 D：δ属 E：以上都不是 2.下列哪种消毒剂不能有效灭活病毒 A:乙醚 B:75％乙醇 C:氯己定 Ｄ：过氧乙酸 E：氯仿 3。关于新型冠状病毒标本的包装，下列说法正确的是Ａ：标本采集后在生物安全二级实验室生物安全柜内分装 B：所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧 Ｃ：容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期
Ｄ:将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本 Ｅ:以上都正确 ４。关于新型冠状病毒的标本保存，下列说法不正确的是 A：能在24小时内检测的标本可置于4℃保存 B:2４小时内无法检测的标本则应置于—70℃或以下保存 C：血清可在4℃存放３天，-20℃以下可长期保存 D：应设立专库或专柜单独保存标本 E：标本运送期间可反复冻融 5.２019新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性生物材料的运输包装对应的联合国编号为 A：ＵN2814 B：UＮ１602 Ｃ:UＮ3373 D:ＵN9284 E:ＵN１60５ 1.设计有缓冲间的实验室是 A：BＳＬ-1实验室 B:普通型BSL—2实验室 C：加强型BSL-2实验室 D：所有级别的实验室 2.BSL－3实验室辅助工作区应至少包括 Ａ:监控室、清洁衣物更换间和淋浴间 B:监控室、清洁衣物更换间和防护服更换间 C：监控室、清洁衣物更换间和缓冲间 Ｄ：监控室、防护服更换间和缓冲间 3。工作人员应穿着配有生命支持系统的正压防护服的实验室是 A：普通型BSL-2实验室
病毒核酸检测流程 展开全文 病毒核酸实验室检测步骤 具体操作如下： 1. 病毒采样：取病人唾液或者鼻咽拭子于病毒采样管保存 2. 核酸提取：提取病人唾液或者鼻咽拭子样本里的遗传物质，如果病人携带病毒，则样本里就会有该病毒的遗传物质RNA,使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期
保存的DNA应置于-70℃或液氮保存。 3.逆转录合成cDNA:进行提取液中RNA的逆转录，把RNA 逆转录成cDNA 逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA 酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化RT-PCR 一步法试剂进行第一轮扩增反应。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。 3. PCR扩增反应（使用二次扩增的套式PCR扩增方法）:用病毒cDNA的特异性引物进行PCR扩增 PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板（DNA 或cDNA）。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式PCR扩增方法。 5. 结果分析判定：
若有扩增出病毒的DNA条带，则判定病人体内有该病毒 若没有扩增出DNA条带，则判定病所取样本无该病毒 实验注意事项： ①每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。 ②核酸检测阳性：发现核酸阳性反应，应该重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判定为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。 ③核酸检测阴性：只可报告本次实验结果阴性。
核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用 输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing, NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。 1. NAT在血液筛检中的必要性 酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV和HIV 的危险性分别为1∶66000、1∶103000和1∶676000[1]。这些危险的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immuno silent infection)以及人工操作错误[2]。所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长, 如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV检测的“窗口期”分别为45-56ｄ、22ｄ、72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性来自“窗口期”感染献血[6]。EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。 NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。NAT敏感性高,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”。初步研究表明,混合血样NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d(缩短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)[5,7];此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。如法国应用NAT,从大约150万份献血中筛检出4份HCV RNA阳性、抗体阴性的样本,其中1份即为免疫静默感染[8]。尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10]。 2. NAT检测的技术方法 1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着NAT 的诞生。随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法[11]。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。 2.1 PCR扩增方法 PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。 目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,
植物检疫专业核酸检测方法验证程序（试行） 第一章总则 1.1 目的 为提高植物检疫专业核酸检测方法的科学性和适用性，规范验证流程，特制定本程序。 1.2 范围 本程序适用于标准制修订过程中核酸检测方法的验证，包括采用现有方法和自主研发的新方法制修订的标准。此外，实验室采用非标准方法及自主研发新方法时,也可参照本程序用以判定其可靠性，不做强制性要求。 若所制定的标准为等同采用国际标准，仅采用第二章中本实验室验证程序即可，但鼓励标准制修订方进行完整的验证流程。若所制定的标准为修改采用国际标准，且修改了关键性技术，则应进行完整的验证流程。 1.3 组织机构 植物检验检疫标准化专业技术委员会（以下简称“委员会”）负责本专业有害生物核酸检测方法验证的组织、审核等管理工作。委员会通过下设秘书处承担具体职责，包括审核验证实验室的资质，指定并组织验证实验室开展验证工作，组织专家进行验证材料的审核及验证数据的统计分析等。 1.4 术语与定义 1.4.1核酸检测方法验证 核酸检测方法验证（以下简称：检测方法验证）是确认某一核酸检测方法
适用于某一检测对象的过程。 1.4.2 本实验室验证 标准制修订实验室在合理的时间间隔内，以方法适用范围内不同样品为对象，对同一方法的验证指标进行确证的过程，初步判断方法可靠性。 1.4.3 独立实验室验证 独立于标准制修订方的实验室验证，判定方法的验证指标能否达到预期用途。 1.5 验证程序 开展验证工作的具体步骤如下，验证程序图见附录A。 1.5.1 本实验室验证 （1）标准制修订方完成方法草案，并设计验证方案。 （2）标准制修订方根据验证方案完成验证，并向秘书处提交验证材料。验证材料应包括标准草案、验证方案和验证报告。 （3）秘书处组织专家审核验证材料的完整性与有效性。 1.5.2 独立实验室验证 （1）标准制修订方的验证材料审核通过后，秘书处组织实验室进行独立实验室验证。 （2）验证实验室完成验证后，直接提交验证实验报告及验证评价报告至秘书处。秘书处组织专家审核独立实验室的验证评价结果。 1.6 验证结果的应用
附件1 呼吸道病毒多重核酸检测试剂 技术审查指导原则 （征求意见稿） 本指导原则旨在指导注册申请人对呼吸道病毒多重核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对呼吸道病毒核酸测定试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则未包含的研究内容，可自行补充。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是
全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。 本指导原则适用于呼吸道病毒多重核酸检测试剂，适用样本类型应为鼻咽拭子、咽拭子、肺泡灌洗液、痰液或其他呼吸道分泌物样本等。检测对象应可引发相似的临床表现，可包括但不限于： 甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道感染肠道病毒（肠道病毒/鼻病毒）、冠状病毒、博卡病毒。 本指导原则适用于利用荧光探针聚合酶链式反应（Real-time PCR）或其他分子生物学方法，以特定的呼吸道病毒基因序列为检测目标，对来源于人体样本中的呼吸道病毒核酸进行体外定性检测，临床用于辅助诊断呼吸道病毒感染相关性疾病。涉及其他临床用途的呼吸道病原体核酸检测试剂可参考本指导原则。 二、基本要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其他内容，其中其他包括同类产品在国内外批准上市的情况。与预期用途相关的临床适应症应重点描述呼吸道病毒型别与临床适应症的相关性及相关病毒在我国的流行特征；产品
全面推行核酸检测试运行工作方案 为预防和控制经血传播疾病的发生，保障临床用血质量和安全，经研究决定我站将全面开展核酸检测。为稳步推进核酸全面检测，不影响血液批放行，满足临床用血需求，制定本 试运行方案。 一、组织管理 为顺利开展全面核酸检测工作，成立核酸检测工作小组，工作组负责全面推行核酸检测试运行工作，协调处理试运行过程中的相关问题。核酸检测工作小组由田站长总负责，分管 站领导和相关科室积极配合。 二、工作目标 根据卫计生发〔2013〕22 号，国家卫生和计划生育委员会关于印发全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013 —2015 年）提出的工作目标，到2015 年，血液筛查核酸检测基本覆 盖全国。 2014 年 5 月 27 日，山东省卫计委又下发了“关于全面推进供血核酸检测工作的通 知”，要求各市要按照原卫生部《全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013-2015年）》要求，迅速开展核酸检测工作。确保 2014 年下半年在全省全面开展供血核酸检测。为全面推进我站核酸检测工作，目前前期准备工作已就绪，人员、设备、资金已到位。经研究决定自2014年7 月 1 日开始对我站所有献血员标本（包括沂源采血点）进行核酸检测。 三、保障措施 1、资源保障：器械科购买进口核酸采血管，仅供沂源采血点使用，为沂源采血点配备标本 离心机二台（一台备用），购买标本运输箱 3 个（ hiv 送检一个，沂源采血点一个，备用一个）。 （确认 6.20 号之后到位， 6.30 前完成） 2、沂源采血点标本的运送：沂源采血点工作人员严格按《血液标本留取程序 》留取标本和离心，置于2-6 ℃冰箱保存。标本由计划送血人员运回。根据工作需要，沂源计划送血增加一次，同时减少一次急症送血。即每周二、四、六计划送血三次，中午下 班时由送血司机把标本及原料血捎回。为保证核酸标本检测不超 48 小时，沂源采血点工作人员工 作时间调整，接血当日下午采血点工作人员休息，周日休息。 3、机采血小板计划的下达：血液供应科提前和临床沟通，说明我站下一步的工作目标和 任务（全面核酸检测并纳入批放行）及造成的血液供应时间的变更，达成共识，取得谅解。 合理安排血小板预约和采集计划，血小板采集计划截止到每天下午16：00 点之 前。？？？？？？ 4、机采血小板标本的交接：机采成分科按照血液供应科下达的采集计划预约献血员，安 排献血员第二天早上7：30 分之前到达血站，血小板标本必须于每天上午9： 30 之前分别与 酶免实验室和核酸实验室当面交接。 5、全血标本的交接：各采血点 2014 年 7 月 1 日起，所有采集的血液同时留取核酸标本和 酶免实验室标本。待检室每天早上与酶免实验室和核酸实验室当面交接标本，未检、待检 和待放行的原料血和成分血分别存放并标识。 四、核酸检测 1、核酸实验室与酶免实验室同步对当天采集的单采血小板标本和前一天接回的沂源采血 点的标本进行血筛三项检测，并对酶免实验室前一天初次检测无反应性的标本进行血筛三项的 检测，对酶免实验室前一天初次检测单试剂呈反应性的标本进行血筛三项的单检模式，每 天15:30 前完成实验。若遇拆分标本，及时与相关科室沟通，调整放行和血小板发放时间， 并且完成当天拆分检测，保证该批试验中不留待测的标本。若遇突发应急事件，核酸实验室和 酶免实验室同步检测。每天核酸检测完毕后出具书面检测报告交血液质量控制科、血液成 分制备科和献血服务科机采成分。 2、质量保证：核酸实验室应建立室内质控标准操作规程，实验室的每一批检测应至少有
新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范 为落实国务院应对新冠病毒感染肺炎疫情联防联控机制《关于做好新冠肺炎疫情常态化防控工作的指导意见》（国发明电〔2020〕14号）以及《关于加快推进新冠病毒核酸检测的实施意见》（联防联控机制综发﹝2020﹞181号）有关要求，指导各地新冠病毒混采检测工作，进一步提升核酸检测能力和效率，针对新冠病毒核酸10合1混采检测（10-in-1 test）技术（指将采集自10人的10支拭子集合于1个采集管中进行核酸检测的方法），制定本规范。 一、样本采集耗材规格 （一）病毒采集管。 管帽和管体应当为聚丙烯材质，螺旋口可密封，松紧适度。管体透明，可视度好。试管外径（14.8±0.2）mm×（100.5±0.4）mm, 管帽外径（15.8±0.15）mm,高度（12.5±0.5）mm。容量企业定标10 ml，内含6ml胍盐或其他有效病毒灭活剂的保存液。保存液应当带有易于观察、辨识的颜色（如粉红色），并保持一定的流动性，方便取样。 （二）采集拭子。 宜选用聚酯、尼龙等非棉质、非藻酸钙材质的拭子，且柄部为非木质材料。折断点位于距拭子头顶端3cm左右，易于折断。
二、采集地点要求 选择空旷、通风良好的场地作为大规模人群筛查集中采集地点。根据原有场地条件，划分为等候区、采集区、缓冲区和临时隔离区，有效分散待检人员密度。应当设置急救设备备用。 （一）等候区。 设置人行通道，同时设置一米线保证等候人员的防护安全。根据天气条件配备保温、降温，遮阳、遮雨等设施。老年人、儿童、孕妇和其他行动不便者优先采集。 （二）采集区。 根据气候条件，配备帐篷、冷/暖风扇、适量桌椅，保证医护人员在相对舒适环境下工作。配备采集用消毒用品、拭子、病毒采集管，并应当为受检人员准备纸巾、呕吐袋和口罩备用。标本如无法及时运送至实验室，需准备4℃冰箱或低温保存箱暂存。应当制定防止病原微生物扩散和感染的应急预案。 （三）缓冲区。 空间应当相对密闭，可供采集人员更换个人防护装备，放置与采样点规模相匹配的防护用品、采集用消毒用品、拭子和采集管，户外消杀设备。 （四）临时隔离区。 用于暂时隔离在采集过程中发现的疑似患者或高危人
第六章 第一节分子生物学基本知识 一、DNA禾口RNA DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。 DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。 在动植物、细菌和真菌中都含有DNA,但在病毒中不一定含DNA DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。 它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变性后0D值会升高。 因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。 在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。 DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。 RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递 作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。 RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。 二、DNA的复制和修复 细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。 DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。 在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。 DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。
在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。 在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。 在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。 在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶I,而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶II。 该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括S I 核酸酶。 逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。 三、转录 在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。 它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。 合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。 大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其°亚基有启动子作用。 四、翻译 再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。 构成核糖体骨架的是rRNA而mRNA直接决定蛋白质的结构。 4 种核苷酸排列组成遗传信息,很撑蛋白质时转换成20 种氨基酸的排列顺序,遗传信息的这种转换称为翻译。 3 个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一 种，DNA3个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。 在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位