流式细胞仪培训(ppt 42页)

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流式细胞仪培训(ppt42张)

PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号，光电二
极管用于检测较强的FSC信号
阈值

阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常
来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
荧光补偿

采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差
荧光补偿
补偿调整的实验过程
流式细胞仪的检测对象
藻类细胞
染色体
血细胞
原生动物细胞
任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析
流式细胞仪工作原理示意图
流式的基本组成： 1.流动室和液流系统 2.光路系统 3.电系统
流式细胞仪可提供的信息

物理信息：通过散射光信号反映

相对细胞大小相对细胞颗粒密度和内部复杂度
流式细胞仪原理与应用
陈玉婵
提

要
流式细胞仪简介流式细胞仪工作原理流式实验流程流式细胞术的应用
流式细胞术的发展史

1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。） 1960s晚期发展：荧光检测细胞计、细胞分选器检测细胞的荧光信号、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。

DNA含量分析-PI染色
细胞凋亡

细胞膜分析-PS外翻
PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白 Annexin-V可与PS结合

流式细胞仪培训课件

•流式细胞仪培训
•8
流式细胞仪的主要特点
➢ 高速测定细胞，大样本计数 ➢ 检测稀有细胞 ➢ 多参数分析 ➢ 自动化 ➢ 细胞分选
•流式细胞仪培训
•9
二、流式细胞仪工作原理
•流式细胞仪培训
•10
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。
•32
Hoechst
Hoechst+Vera.
Side Population Cells
•流式细胞仪培训
•33
细胞凋亡研究
1. 鉴别凋亡与坏死: Annexin Ⅴ/PI
2. 测定凋亡率:Annexin Ⅴ、 Apo 2·7、TUNEL
3. 研究凋亡触发机制： Caspase、Fas及FasL
bcl-2/bax
疾病
CD3 CD4 CD8
自身免疫病
降低增高
CD4/ NK CD8 降低降低
AIDS SARS
降低降低
严重降增高低
降低降低
降低降低降低
慢性活动性肝炎、肝硬化
肿瘤
降低
降低降低
正常或增高增高
降低降低降低降低
•流式细胞仪培训
•27
用荧光标记抗体
抗体特异性地结合细胞上对应的抗原
•31
肿瘤干细胞中的研究应用 -Hoechst 33342 side population

流式细胞仪原理及试剂销售培训课件

提供专业的技术支持
为客户提供专业的技术支持，解答他们在使用流式细胞仪和试剂过程中遇到的问题，增强客户对产品的信任感和满意度。
03 流式细胞仪试剂市场分析
试剂市场现状和发展趋势
试剂市场现状
目前流式细胞仪试剂市场呈现出稳步增长的趋势，市场规模不断扩大，产品种类日益丰富。
发展趋势
随着技术的不断进步和应用领域的拓展，流式细胞仪试剂市场将朝着高品质、高附加值的方向发展，同时个性化定制的需求也将逐渐增加。
流式细胞仪原理及试剂销售培训课件
contents
目录
• 流式细胞仪原理简介 • 流式细胞仪试剂销售技巧 • 流式细胞仪试剂市场分析 • 流式细胞仪操作和维护 • 流式细胞仪在科研中的应用案例 • 流式细胞仪的未来发展展望
01 流式细胞仪原理简介
流式细胞仪的基本结构和工作原理
流式细胞仪的基本结构
流式细胞仪的技术优势与局限性
技术优势
流式细胞仪具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，可以同时检测多个细胞参数，并且能够在短时间内处理大量样本。此外，流式细胞仪还具有自动化和智能化的特点，可以大大提高实验效率和数据的准确性。
局限性
流式细胞仪的价格较高，操作和维护需要一定的专业知识和技能。此外，由于流式细胞仪采用液流聚焦技术，对于某些特定类型的细胞或大小差异较大的细胞可能存在一定的局限性。
随着市场竞争的加剧，流式细胞仪企业需要加强技术创新和市场开拓，提高品牌知名度和影响力。
新的应用领域的机遇
随着医疗保健、生物技术和制药等领域的发展，流式细胞仪将有更广泛的应用领域和市场空间。
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流式细胞术和应用PPT培训课件

异荧光细胞生长好、避免反复吹打
彻底消化
增加抗体量、延长反应时间
五、数据分析处理
WinMDI软件等。单参数直方图双参数二维点图等高图三维图
设门：
散点图
限定要分析的目的细胞群，FSC vs SSC点图是传统上用于设门的图；
补偿模型图
补偿调节前后对比
二、荧光染料的选择
1.细胞表型分析双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5或 PerCP-CY5.5。四色分析：三色分析+APC或PE-CY5。
2.胞内蛋白与周期的关系分析蛋白标记：FITC或GFP，DNA标记：PI
3.凋亡与坏死分析：凋亡用Annexin V-FITC，坏死用PI。
流式细胞术和应用
内容
一、流式细胞术工作原理二、荧光染料选择三、抗体选择四、样品制备及对照设置五、数据分析处理六、流式细胞术的应用
一、流式细胞术工作原理
（一）流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM，Flow Cytomytry）指利用流式细胞仪(Flow Cytomyter)对处于快速流动的荧光染色的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。凡是能被荧光素标记的且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。
PE-Cy5与APC干扰。
二、荧光染料的选择
488nm激光激发的染料： FITC：异硫氰酸荧光素，绿色，513nm PE：藻红素，橙黄色 575nm，信号最强 PerCP ：多甲藻黄素-叶绿素蛋白，深红色，675nm PE-Cy5 (PC5) ：670nm PE-Cy5.5 (PC5.5)：667nm PE-Cy7 (PC7) ：767nm PI (碘化丙啶）：617nm

流式细胞仪 ppt课件

ppt课件
9
常用荧光染料的特性
荧光染料激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光橙色
ECD
488
620
免疫荧光橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光红
PI
488
620
DNA染色橙红
PECy7 488
755
免疫荧光深红
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7
流式细胞检测样本的制备：细胞样本的处理：组织样本的处理流式细胞仪检测的信号：散射光信号：前向角散射光（Forward scatter， FSC) 与细胞大小有关；侧向角散射(Side scatter ，SSC，又称90°角散射光）与细胞精细结构和颗粒性质有关，对胞膜、胞质、核膜变化更敏感。荧光信号：特异性荧光信号是指将荧光素分子耦联到特异性抗体或分子上，当其与细胞表面或者胞浆中的抗原结合后，被特定波长激发光激发而产生的信号；自发荧光：个别的细胞有着他们各自特异性水平的自发荧光（荧光信号产生于他们自身）。
流式细胞仪 FLOWபைடு நூலகம்CYTOMETER
基本概念和原理
ppt课件
1
2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级为FC500/MPL
Cytomics FC500
ppt课件
2
流式细胞术的基本概念
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以快速、准确、客观，能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，并且可以对特定群体加以分选。其中用到的流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。在国外又把流式细胞仪称为荧光激活细胞分选器（ Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS），所以目前大多数流式细胞仪机型都以FACS命名。

《流式细胞仪》课件

便携式设备的应用
将流式细胞仪的设备体积继续缩小，大量应用于生物界的基础研究以及医学检测和移动采样等领域。
流式细胞仪的市场前景评估
1 市场规模
2 主要厂商
3 市场推动因素
流式细胞仪市场规模呈自上世纪六十年代发明起逐年扩大的趋势，预计到2027年达到40亿美金。
Becton, Dickinson and Company、Beckman Coulter、 Merck Millipore等公司产品市场占领率较高。
灯源
氙气灯、汞灯、钨丝灯等不同的光源都可以被用作流式细胞仪的光源，不同灯源在功率、波长、寿命等方面存在差异。
探测器的选择
1
荧光检测器
是流式细胞仪检测系统的关键组成部分，不同的检测器可以检测不同的荧光参数，如细胞大小、细胞形态、细胞核酸含量等。
2
散射检测器
散射检测器可检测颗粒的大小和光密度信息，如侧散射检测器用于检测细胞的大小和形态，前散射检测器检测颗粒的光密度信息。
3 准确记录
记录样品来源、批号和实验日期等信息，并保证实验室干净卫生。
样本的处理与染色
细胞损伤
避免长时间的离心和过滤，防止细胞的膜破坏和凋亡。
细胞处理
使用重组蛋白等方法对细胞进行特定功能标记的处理。
荧光染色
使用专门的生物染料与细胞反应后，在流动细胞仪中检测荧光信号。
流式细胞仪的参数设置
软件设置
流式细胞仪最早由韦斯利·莱恩和墨菲博士等人于1965年开发。自此以后，它经历了巨大的技术发展和应用范围的扩大。
用途
流式细胞仪可应用于人类疾病的研究、药物开发、医学诊断、基因工程、环境监测等领域。
流式细胞仪的原理

《流式细胞仪》幻灯片PPT

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜外表抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进展计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
电子系统负责光电转换和数据处理
1 散射光信号
侧向角散射光〔SSC〕 Side Scatter：细胞粒度及细胞内相对复杂性
激
前向角散射光〔FSC〕
发光
Forward Scatter：细胞相对大小及其外表积
光散射分析：从非均一的细胞群体中鉴别出某些亚群
流式细胞仪的信号分析
外周全血细胞散射光双参数点图〔红细胞溶解后〕
新型流式细胞仪，特点：随着激光技术的
二、流式细胞仪的构造组成
Principles of Flow Cytometric analysis
➢ 液流系统 ➢ 光学系统 ➢ 电子系统 ➢ 分选系统
三、流式细胞仪的根本构造
液流系统
液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。
根据散射光信号从人白细胞中鉴别出不同亚群：
白细胞
淋巴细胞单核细胞粒细胞
流式细胞仪的信号分析
2荧光信号
利用荧光标记的特异性单克隆抗体，做单/多色分析：检测多种细胞外表标志，定量细胞抗原表达、细胞因子水平为PCR、FISH 等分子技术分选出纯度高的特异细胞群
流式细胞仪的信号分析
荧光信号的分析
流式仪器一览
流式细胞仪一览

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细胞膜电位的改变
超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少。
染料和试剂
DiOC6(3) DiOC5(3) DiOC1(3)
Valinomycin
Gramicidin D CCCP
流式细胞仪工作原理示意图
流式的基本组成： 1.流动室和液流系统 2.光路系统 3.电系统
流式细胞仪可提供的信息
物理信息：通过散射光信号反映
相对细胞大小相对细胞颗粒密度和内部复杂度
荧光信息：通过荧光强度反映
散射光信号的产生
488nm激光产生散射光
1. 散射光信号
前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信号反映细胞相对大小及其表面积
侧向角散射光（SSC, Side Scatter）入射激光90角的散射光信号反映细胞粒度及细胞内相对复杂性
散射光
散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异
通常使用“散点图”来看散射光信号散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒
的数据
利用散射光信号对混合细胞分群
2. 荧光信号
荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的
流式细胞仪原理与应用
陈玉婵
提要
流式细胞仪简介流式细胞仪工作原理流式实验流程流式细胞术的应用
流式细胞术的发展史
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。）
流式检测结果的表示方法
百分率绝对计数平均荧光强度图形：直方图、散点图
流式细胞仪可以告诉我们什么？
流式细胞术的细胞学应用
细胞结构细胞大小细胞流式细胞术的细
胞学应用粒度细胞表面面积核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量蛋白质含量染色体分析
细胞功能细胞表面/胞浆/核的
1960s晚期发展：荧光检测细胞计、细胞分选器检测细胞的荧光信号、单克隆抗体技术
1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪 FACS I。
什么是流式细胞仪？
在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器
仪器特点：单个细胞通过狭窄激光束，产生能够反映细胞
荧光信号越强
荧光信号的表示方法
双参数点图
单参数直方图
一个完整流式实验的组成
样品的处理调整仪器条件数据处理
1.样品处理
单细胞悬液的制备
浓度51051 106/mL 外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过
滤) 制成单细胞悬液
选择合适的荧光染料染色
必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范
大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分
能发射出不同的荧光。
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
流式细胞仪的检测对象
藻类细胞
染色体
血细胞
原生动物细胞
任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析
变，对细胞周期的干扰，对细胞内钙离子水平的影响病毒引起的凋亡
流式细胞仪的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查 HLA-B27检查血小板功能及相关疾病
特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡
流式细胞仪在微生物研究中的应用
DNA 蛋白过氧化物生成胞内pH 鉴别死/活细菌和酵母菌并计数区分革兰氏阳/阴性细菌研究酵母菌细胞器基因表达-绿色荧光蛋白病原菌与吞噬细胞的关系-吞噬引起的呼吸爆发病毒-细胞相互作用：病毒感染导致细胞蛋白表达的改
补偿调整实验
藻类细胞绝对计数
细胞周期分析
DNA含量分析-PI染色
细胞凋亡
细胞膜分析-PS外翻
PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白 Annexin-V可与PS结合Leabharlann 细胞凋亡细胞生理学研究
Ca2+流动性检测
Ca2+ 是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。
第二步：单阳性样本调整补偿判断标准：
补偿模型
FITC单染
补偿前
补偿后
PE-X%FITC
数据分析
设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平
均荧光值，绝对数或抗体结合数
设门
设门的意义：选定要分析的目标细胞
设门
如何设定阴性与阳性的界限
阈值
阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常
来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
荧光补偿
采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差
荧光补偿
补偿调整的实验过程
样本准备：阴性样本，单阳性样本调整：第一步：阴性样本调整所有PMT
围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少
2.仪器条件的确定
电压阈值荧光补偿（多色分析）
电压
处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电压）。调整电压，可使信号强度改变。
BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。
PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号，光电二极管用于检测较强的FSC信号
最常用的染料
Indo-1 Fluo-3 Fura red
excited at UV excited at 488nm excited at 488nm
细胞生理学研究
细胞活性分析
Fluorescein Diacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光
细胞生理学研究