遗传学第三章

• 这种鸟枪法是小的原核生物测序的标准方法，但是对 于较大的真核生物基因组来说是相当困难的，特别是 当分析基因组的重复区域时会发生错误。
几十个碱基
鸟枪法组装序列
丢失 鸟枪法中遇到的问题－串联重复DNA
错误拼接 鸟枪法中遇到的问题－基因组范围内的重复
1. 概述
• 因此，必须首先建立一个基因组的图谱，通过标明基 因或其他显著特征的位置，为测序提供指导。
• 形态标记 • 细胞学标记 • 生化标记 • DNA分子标记
所有的标记都必须具有多态性！
DNA分子标记
简称分子标记 指在DNA水平，具有相对差异的等位基因的DNA多
态性标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映。
优点： ❖ 不受时间和环境的限制 ❖ 遍布整个基因组，数量无限 ❖ 不影响性状表达 ❖ 变异丰富，多态性好 ❖ 大部分为共显性，能鉴别纯合体和杂合体
Mapmaker Version 3.0
Joinmap Version 3.0
3. 遗传作图
3.3 遗传连锁是遗传作图的基础 C. 用于关联分析的软件
TASSEL
Structure
4. 物理作图
遗传图谱的局限性： 1. 遗传图谱的分辨率依赖
于所得到的交换数目； 2. 遗传图谱的准确率有限
酿酒酵母第3号染色体遗 传图谱与物理图谱的比较
• 在过去，探针必须是相当长的DNA的分子，通常至 少是40kb的克隆片段；随着荧光信号放大技术的应 用，现在最小可以检测500bp的DNA片段。
荧光原位杂交
（fluorescent in situ hybridization，FISH）
荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH）
一种封闭探针重复序列的方法
4.2 荧光原位杂交（FISH）
B. FISH应用的局限性
• 中期染色体是高度凝聚的，每条染色体都具有可识 别的形态。
• 使用中期染色体的缺点在于，由于它的高度浓缩的 性质，只能进行低分辨率作图，两个标记间至少相 隔1 Mb才能分辨出来。
• 因此，中期染色体FISH主要用于确定新标记在染色 体上的大概位置，为更精细的作图做准备。
人的基因组中大约 有4x106个SNP; 绝大多数SNP是双 等位基因； 有的能形成RFLP ，绝大多数不能。
a. 通过寡核苷酸杂交分析检测SNP
寡核苷酸是在试管中合成的长度小于50 bp的DNA分子 ，在高严谨杂交条件下，寡核苷酸只有与待测DNA分子 形成完全的碱基配对时，二者才能杂交；如果有一个碱 基错配，杂交体会非常不稳定，不能形成杂交信号。
基因组测序的两种方法
2. 遗传图谱和物理图谱
遗传图谱：指应用遗传学技术（遗传重组）构建的能在 基因组上显示基因和其它序列特征位置的线性排列 图，反映了基因或标记间的相对距离和顺序。cM
物理图谱：指应用分子生物学技术直接分析DNA分子 ，从而构建的能显示包括基因在内的序列特征位置 的图谱，它反映了基因或标记间的实际距离。 bp，kb，Mb
• 操作较繁琐，数据积累速度太慢。
4.2 荧光原位杂交（FISH）
B. FISH应用的局限性 更精细作图的两种途径：
当淬灭复合物与荧光染料相 邻时，无荧光发出；如果寡 核苷酸与待测DNA能够杂交 ，则会破坏环形结构，此时 淬灭复合物远离荧光染料， 有荧光发出。
b. 通过耐扩增突变系统检测SNP （Amplification Refractory Mutation System, ARMS）
将SNP位点引入PCR引物3’端的 最后一个碱基，直接进行PCR扩 增。 在严谨的PCR条件下，存在SNP 的引物对不能扩增出目的条带。
4.2 荧光原位杂交（FISH） A. 用荧光探针进行原位杂交
• 用于原位杂交的探针的标记要同时满足高灵敏度和 高分辨率两个条件，非放射性的DNA荧光标记技术 能满足这一要求。
• 现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，可以 将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每 种杂交信号，从而检测出各探针的相对位置。
• 一旦得到了基因组图谱，基因组计划中的测序阶段可 以采用下面两种方法之一进行：
(1) 全基因组鸟枪法（whole-genome shotgun）：使用 基因组图谱上的显著特征为界标，指引着将用鸟枪 法获得的大量短序列拼接成主序列。
(2) 克隆重叠群法（clone contig）：将基因组打断成长 度为数百kb或数个Mb的大片段，将这些大片段定位 到基因组图谱上并拼接成重叠群，利用鸟枪法对大 片段分别测序后再进行拼接。
B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
• 如果使用的限制酶在DNA上切点相对较少，构建限 制性图谱就比较容易。
• 限制性作图更适用于小分子。如果DNA分子小于50 kb，通常选用6碱基识别序列的限制性酶来构建限 制图谱。
• 对于大于50 kb的DNA分子，可以选用“稀有酶” 进行构建。
4.1 限制性作图
4. 物理作图
4.1 限制性作图 （Restriction mapping）
4.1 限制性作图
A. 限制性作图的基本方法
1) 双酶解（double digest） Key：分析重叠片段
2) 部分酶解+完全酶解：比较分析这两种情况下的片 段大小。
3) 末端标记+部分酶解 a) 利用放射性的同位素标记DNA的3’端或5’端 b) 部分酶解 c) 放射自显影
正交变电场凝胶电泳
两对电极间的电场可以改变，每对电极与凝胶长度方向成45度角； 电场的每次改变都迫使DNA分子重新排列，从而提高分辨率。
4. 物理作图
4.2 荧光原位杂交（FISH）
A. 用荧光探针进行原位杂交
原位杂交是以标记的DNA分子 为探针，检测完整染色体的一 甲酰胺 种杂交分析方法。
分裂中期染色体
1) 双酶解
2.9 kb的DNA片段 பைடு நூலகம்coR I+BamH I
EcoR I BamH I
1.0 0.5
1.2
1.5 KB 1.4 KB
1.2 KB 1.0 KB 0.7 KB
E
1.2 KB 1.0 KB 0.5 KB
BE E
0.5 0.2
B
EB
0.2 KB
0.2
BE
1
2
1.0 0.5 0.2 1.2 B EB 限制酶切图谱
Chapter 3 Mapping Genomes
内容
1. 概述 2. 遗传图谱和物理图谱 3. 遗传作图 4. 物理作图
1. 概述
• 测序工作中有一个局限性：在一个测序反应中一般只 能测出1 kb左右的准确序列。这就意味着长的DNA分 子必须由一系列短的序列拼接而成，即需将大分子分 解为片段，测出每一段的序列，再用计算机寻找重叠 的部分，从而拼接成长的序列－鸟枪法（shotgun）。
A. 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism，RFLP） 用限制性内切酶酶切基因组DNA时，在同一种生物的不 同个体间出现含同源序列的酶切片段长度的差异。
人的基因组中大 约有105个RFLP
确 定
R
F
L
P
的
酶切扩增多态性序列（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS）
通过荧光标记显示出DNA探针在染色体上的位置
如果探针中含有一 些重复序列，它可 能会和染色体上的 多个位点发生非特 异性杂交； 因此，探针在使用 前要和来自被研究 组织中的未标记 DNA混合； 用于混合的未标记 DNA可以是总的 核DNA，但最好 是富含重复序列的 DNA片段。
这时探针只与特异序列发生杂交
2) 部分酶解+完全酶解
完全酶解
1200bp 1000bp
部分酶解
3000bp 2200bp 1800bp 1200bp 1000bp
800bp
800bp
800bp 1000bp
* 1200bp
R
R
部分酶解
3000bp 2200bp
3)末端标记+部分酶解
1200bp
3) 末端标记+部分酶解
4.1 限制性作图
两
种
方
法
B. 简单重复序列
Simple sequence repeat, SSR, Microsatellite (微卫星) 指重复单位相对较小（2-6bp的基序），由于重复单位 数目的变化而形成的多态性。
SSR
人的基因组中大 约有5x105个SSR
PCR+平板PAGE 电泳
PCR+毛细管电泳
引物需要荧光标记 可获得片段的准确长度
交变脉冲场凝胶电泳（PFGE）：1984年，Schwartz和
Centor发明；这项技术采用定时改变电场方向的交变电源， 每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方 向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。
• 正交变电场凝胶电泳（OFAGE） • 电场转换凝胶电泳（FIGE） • 等高加压均匀电场（CHEF）
3. 遗传作图
3.3 遗传连锁是遗传作图的基础
A. 遗传群体的构建
• 分离群体
P1 P2
P3
连续回交 F1
回交群体（NIL）
• 收集的品种群体
组织培养
三交群体 F2
单倍体
连续自交 染色体加倍
RIL
DH
3. 遗传作图
f2 backcross ri self
3.3 遗传连锁是遗传作图的基础
B. 用于绘制遗传图谱的软件
1992
4. 物理作图
物理作图的常用方法：
1) 限制性作图：在DNA分子上定位限制性内切酶酶 切位点的相对位置；