中国药品检验标准操作规范2010年版104无菌检查法

无菌检查法

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常验证还需对试验环境进行监控。

菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。

第一部分 准备及保障

1 洁净室（区）的要求

无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。无菌加查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

洁净室（区）应采光良好、避免潮湿。远离厕所及污染区。由1~2个缓冲间和操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。在缓冲间内应有拖鞋、无菌衣放置架和挂钩等，缓冲间可设手消毒设备，不应放置培养箱和其他杂物；洁净室（区）内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间和缓冲间内不应安装下水道。

无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18~26℃，相对湿度40%~60%。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外线灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。洁净室（区）内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（2~2.5W·m-3），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40μW·cm-2。不符合要求的紫外线灯应及时更换。

洁净室（区）应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。

洁净室（区）的洁净度检查 洁净室（区）的洁净级别，应首先满足《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》所规定的悬浮粒子标准。洁净室（区）在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断洁净室（区）是否达到规定的洁净度，应按沉降菌和浮游菌所规定的测试方法执行。同时，应动态跟踪监测表面接触菌和手套菌。 悬浮粒子测试方法及标准：本方法采用计数浓度法，即通过测试洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某粒径的悬浮粒子数，来评定洁净室（区）的悬浮粒子洁净度级别。洁净室（区）的测试人员应选择与生产操作的空气洁净度级别要求相适应的穿戴方式，测试仪器必须按照仪器自身的检定周期，定期对仪器作检定。应使用检定合格，且在使用有效期内的仪器。应注意避免测试仪器对待测洁净环境的污染，必要时对仪器进行表面清洁消毒，或使用无菌的仪器罩。也可在相应的洁净室内准备和存放。测试宜在操作人员撤离现场且净化空气调节系统正常运行时间不少于30分钟后开始，采样点数目及其布置应力求均匀，并不得少于最少采样点数目，悬浮粒子测试最少采样点数目参考以下公式：

NL=A

式中 NL为最少采样点；A为洁净室或被控洁净区的面积（m2）。

对任何小洁净室（区）或局部空气净化区域，采样点的数目不得少于2个，总采样点次数不得少于5次。每个采样点的采用次数可以多于1次，且不同采样点的采用次数可以不同。悬浮粒子检测结果应满足粒径≥0.5μm的粒数不得超过3.5个/L，≥5μm的粒数为0，空气流速应≥0.35m/s，应根据检测结果定期更换空气过滤装置。

沉降菌检测方法及标准；以无菌方式将3个大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或其他用户认可并经验证了的培养基平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；（或按其他采样点布置方式设置采样点数目及位置，采样点数目可参考悬浮粒子所规定之内容，采样点计划参见附录A）；逐一打开碟盖正置，使培养基表面暴露在空气中，静态测试时，培养基暴露时间为半小时以上；动态测试时，培养基暴露时间为不大于4h。全部采样结束后，并倒置于30~35℃恒温培养箱中培养48h，取出检查，3个平板上生长的菌落数不得超过1个/皿。

浮游菌检测方法及标准：用专门的采样器，宜采用撞击法原理的采样器，一般采用狭缝式采样器、离心式或针孔式采样器，并配有流量计和定时器，严格按仪器说明书的要求操作并定期校验。应注意避免测试仪器对待测试洁净环境的污染，必要时对测试仪器进行表面清洁消毒，或使用无菌的仪器罩。也可在相应的洁净室内准备和存放。使用的培养基为大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或其他用户认可并经验证了的培养基。用于100级洁净室的采样器宜预先放在被测房间内。用消毒剂擦净培养皿的外表面。采样前，先用消毒剂消毒采样器的顶盖、转盘以及罩子内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘。采样口技采样管，使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对采样管的外壁及内壁进行消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，戴无菌手套操作。采样仪器经消毒后先不放入培养皿，开启浮游菌采样器，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min，检查流量并根据采样量调整设定采样时间。关闭浮游菌采样器，放入培养皿，盖上盖子。置采样口于采样点后，开启浮游菌采样器进行采样。100级洁净度的采样体积为1000L，10000剂洁净度采样体积为500L，其余洁净度采集体积为100L。采样点数目可参考悬浮粒子所规定内容，采样点计划参见附录A。全部采样结束后，取出培养皿并将碟盖盖好，倒置于30~35℃恒温培养箱中培养48h，取出检查，用计数方法得出各个培养皿的菌落数，每个测点的结果以浮游菌平均浓度为准。每个测定的浮游菌平均浓度的计算公式为：

平均浓度（个/m3）=菌落数采样量

洁净度为100级区域浮游菌平均浓度应≤5个/m3，洁净度为10000级区域浮游菌平均浓度应≤100个/m3，洁净度为100000级区域浮游菌平均浓度应≤500个/m3。

表面接触菌及手套菌采样计划：在每次无菌检查实验过程中，应动态跟踪监测表面接触菌及手套菌，以无菌方式将采样所需数目之大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或其他用户认可并经验证了的培养基平板（或用表面接触性平皿替代）带入洁净室（区），用无菌脱脂棉擦拭实验用器具表面后，将该脱脂棉均匀涂布于采样平板的培养皿表面；实验人员在样品瓶消毒和其他准备工作后，无菌检查关键操作步骤前必须再用消毒剂消毒手套，在无菌检查操作完成时，将双手接触指面涂抹于另一采样平板的培养基表面。将采样平板倒置于30~35℃恒温培养箱中配有48h，取出检查。

对上述采集之沉降菌、浮游菌、表面接触菌及手套菌应进行菌种的确认实验，即将平板上的单个菌落划线接种至大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）平板上进行纯培养，挑选培养物的单个纯菌落进行革兰染色和镜检，观察其染色特性及微生物形态学特征。并做生化实验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定该菌种属。相关确认鉴定资料应存档备查，相关菌种应随即保藏。

菌株分析及阳性菌操作实验应在专门的阳性实验室进行，阳性实验室应符合国家Ⅱ级生物安全标准。

2 仪器及用具

2.1 洁净室（区）应准备好盛有消毒用5%甲酚或其他适宜消毒溶液的玻璃缸、乙醇灯、火柴、镊子、75%乙醇棉、碘酒棉及拖鞋等。

2.2 恒温培养箱及可调23~28℃的生化培养箱。

2.3 离心机、显微镜、蒸汽灭菌器、标准pH比色器（0.02%酚磺酞指示液和溴钾酚蓝指示液）、恒温烤箱。

2.4 玻璃器皿试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1、5、10ml）、注射器（2、5、10ml）、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。如使用过程中与细菌接触，应先灭菌倒出内容物后再清洗，晾干。凡无菌操作过程中所用的器皿，都应用牛皮纸包扎严密，灭菌。移液管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞少许原棉，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，封严，灭菌待用；试管、离心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2/3处，用牛皮纸将管口（包括塞子）包扎严，灭菌待用；将注射器、针头（9号、11号、12号）配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布（或布）内，包扎严密，置带盖容器（瓷盘或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎后，灭菌待用。长柄取样匙，放于长的不锈钢长筒内，盖严，干热灭菌待用。手术镊、手术剪洗净、擦干。用双层纱布将1把剪刀与1把镊子间隔包扎在一起，放于带盖的容器（瓷盒或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎，灭菌（参照附录XV Ⅱ灭菌法）待用。采用蒸汽灭菌的物品取出时切勿立即置冷处，避免因急速冷却，使灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易染菌，取出后应置恒温培养箱中烘干，待用。

2.5 无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌待用或用一次性的无菌物品代替。

2.6 除菌滤器及滤膜 目前有多种开放式及封闭式滤器；微孔滤膜一般直径50mm、孔径0.45μm。购得一批滤器（膜），需进行孔径大小的测试，一般有三种方法，选其中一种方法即可。

气泡法 先将滤膜浸入水中，使完全湿润，然后用镊子夹住一片滤膜放于气泡点测定装置或滤膜孔径测定仪上，膜上放一块与滤膜大小相同的尼龙筛网，再加上多孔板，将螺旋固定圈旋紧，在多孔板上加3~5mm深的水（注意排除气泡）关闭放气阀，启动空压机或氮气瓶阀，使压力缓缓上升，注意观察水面上产生第一个气泡时，记录压力表的压力，气泡点压力不应小于2.2kg/cm2(0.2Mpa)。

水流量法 将滤膜装于除菌滤器上，开动真空泵，压力在700mmHg（93kPa）下，抽滤已滤清的水约500ml，计算出每1min的滤速。《中国药典》对滤膜的滤速未明确规定，而美国药典（XX Ⅲ）规定在700mmHg（93kPa）压力下，滤过直径47mm；流速55~75ml/min。

细菌截留实验 常用的细菌为粘质沙雷菌(Serratia marcescens)[CMCC(B) 41002]，将该菌的新鲜培养物接种于营养肉汤培养基中，取此菌液，按滤膜面积每1cm2不少于1ml加至无菌0.9%氯化钠溶液中，按薄膜过滤法过滤，收集全部滤液接种于营养肉汤培养基中（滤液体积不得大于培养基体积的10%），30~35℃培养24~48h，应无菌生长。不符合规定的滤膜不得使用。