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毕赤酵母高效表达策略-1

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1.基因的内在特性

主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。

由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’－U TR。尽可能和AOXlmRNA 5’－U TR 相似是

必需的, 最好是保持两者一致。A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成

转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。因此对A T 含量丰富的基

因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%～ 55% 范围内。

巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。（赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.）

外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达

量。 2．选择强启动子

启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇

诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。

通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自

发突变体，从中筛选提高表达量的突变体。（戴秀玉, 王恂, 周坚1 毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) : 559～ 5611） 3．增加外源基因整合拷贝数

（1）Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子（配合电激法转化的效果更好）。

（2）在体外载体上多次插入目的基因片段。 （3）将载体中目的基因两端连上来自宿主或其它非必需高重复的基因片段, 通过同源重组

而达到高拷贝整合的目的。（聂东宋, 梁宋平, 李敏1 外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达

的策略〔J〕1 吉首大学学报(自然科学版) , 2001, 22 (3) : 40～ 41） 4．载体和宿主的选择

KM71转化子是muts 表型,而GS115 转化子主要是mut + 表型,也有一小部分是muts 表型。哪一种表型对外源蛋白的表达量更高,对每一种蛋白而言是不确定的。信号肽也是影响分泌

表达水平的很重要因素。α- 交配因子和目的基因之间插入一个间隔肽(spacer peptide) 可以

提高外源蛋白的表达水平。（王燕,梁镇和,张友尚,等. 人胰岛素在甲醇酵母Pichiapa storis 中

的分泌表达[J ] . 生物化学与生物物理学报,1999 :31(5) :587 - 589.） 5．优化发酵条件 发酵条件主要包括通气量、温度、pH、甲醇含量和培养时间等。 5．1通气量是影响表达水平的极为重要的因素。

用发酵罐进行培养,外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶发酵高出10～100 倍.主要原因是普

通摇瓶发酵的通气不理想,影响了菌体的高密度生长及表达。许多文献报道的表达水平都是

摇瓶发酵条件下的结果,可以推测,如果用发酵罐进行培养,表达水平还会有上升的空间。 5．2碳源也是影响高水平表达的重要因素。

毕赤酵母表达培养基常用的碳源是甘油, 但甘油对AOX 启动子有抑制作用。山梨糖醇代替

甘油作为碳源, 结果生物质量下降, 但外源蛋白的表达有所提高 5．3培养基组成

目前主要有BM GY、FBS 2 种培养基可用于培养P. pastoris。但由于BM GY 既含有磷酸缓冲液又含蛋白胨和酵母提取物, 因而菌株生长更好, 大大增加了生物量, 使表达量也相应大大提高。 5．4甲醇诱导的方式、用量、诱导时间

诱导的方式：两步法(先用甘油培养使细胞达到一定的浓度,再加甲醇诱导) 和联合生长培养的方法(growth - associated ,在早期加入甲醇诱导) 来诱导外源蛋白的表达都有成功的报道。

现在一般两步法来诱导外源蛋白的表达。用两步法来诱导外源蛋白的表达,则诱导时的起始pH 可能是毕赤酵母高效表达重组蛋白的关键之一,通过改变诱导时的pH 值,可使表达量提

高50 %以上。（邱荣德,朱建蓓,王垒,等. 人p53 蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达[J ] . 生物工

程学报,1999 ,15(4) :477 - 481.） growth - associated 是诱导甲醇酵母高水平表达外源基因的很好方法,比普通方法高出10 倍

（Ohashi R ,Mochizuki E ,Suzuki T. A mini - scale mass production and separation systemfor

secretory heterologous proteins by perfusion culture of recombinant Pichia pastoris using a shaken ceramic membrane flask[J ] . Journal of Bioscience & Bioengineering ,1999 ,87 (5) :655 - 660.）

用量：一般甲醇添加量为0. 5 %～1 % 诱导时间（150h）：过短的时间(3d) 表达量很低,过长的时间外源蛋白的降解增加,因此寻求

一个最佳产量时间比就特别重要。 5．4蛋白酶的影响：

有些蛋白质,尤其是小分子肽易于受到蛋白酶(在中性pH条件下容易产生) 的影响。pH 降到3 或更低，使得许多中性pH蛋白酶失活，毕赤酵母能对抗低pH 值,因此低pH 不会影响其生长。也可以考虑用蛋白酶缺失菌株SMD1168 作宿主进行表达。

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毕赤酵母表达

毕赤酵母表达

Pichia酵母表达系统使用心得

摘要： Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。本文搜集多位用户对Pichia的使用心得和注意事项，值得一看。

生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点

与其他真核表达系统比较

与原核表达系统比较

1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点

-

+

2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平

+++

+

3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。

+++

=

4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。

=

+

5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低

+++

+RealTime ready 智力大冲浪！答对5题，即获赠美国傲仕优质保温杯！

+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多

EasySelect Pichia Expression System

产品性能：

优点--使用简单，表达量高，His-tag便于纯化

缺点--酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题

全面产品报告及心得体会：

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

组合策略促进碱性果胶酶在毕赤酵母中高效表达

组合策略促进碱性果胶酶在毕赤酵母中高效表达

研究论文

组合策略促进碱性果胶酶在毕赤酵母中高效表达

陈双全1’"，

刘松1’"，

堵国成*1’"，

陈坚1’"

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122;2.江南大学生物工程学院，江苏无锡

"141"")

摘要：本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果肢酶(

PGL)在毕赤酵母

中的胞外产量。基于密码子偏好性，优化了来源于

sp

.WSHB

04-0"P%L

高热稳定性突变体

K

314M基因，并克隆至

pPIC

9K的

4coR

I

-$o

: I得到

P%L表达载体

pPIC

9K

-P%L。

pPIC

9K

-P%L

转化

%S

115(

his

-)得到重组菌

GS

115/PGL

14#，胞外

P%L酶活达到

301.3" U/mL，较优化前提高

"5.1%。在此基础上，分别及同时共表达分子伴侣内

质网蛋白折叠氧化还原辅助因子（

ER

01)

和泛素共扼酶（

UBC

1)

。结果显示，同时表达

ER

01和

UBC

1(

%S

115/P

%L

1-ER

01-UBC

1 "#)使重组菌胞外

P%L较共表达前提高

49.3D，达到

450.1" U

/

mL。应用指数流加策略对重组菌株

GS

115/PGL

1-ER

01-UBC

1 "#进行

3 L罐发酵，诱导发酵

96

h胞外

P%L可达

1 36".31 U/mL。研究结果对促进

P%L产量的提升及其应用具有重要现实意义。

关键词：碱性果肢酶；毕赤酵母；密码子优化；分子伴侣；指数流加

中图分类号:Q

815 文章编号：1673-1689("019)0"-0035-09 DOI

： 10.3969/j

.issn

. 1673-1689."019.0".006

High-Level Expression of Alkaline Polygalacturonate Lyase in Pichia pastoris

by Using a Combined Strategy

CHEN Shuangquan

1，"， LIU Song1,2, DU Guocheng

毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达实验手册

大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。毕赤用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、2、3］；

毕赤酵母表达实验手册

毕赤酵母表达实验手册

毕⾚酵母表达实验⼿册

毕⾚酵母表达实验⼿册Jnuxz

丁⾹园虚拟社区蛋⽩质技术讨论版

⼤肠杆菌表达系统最突出的优点是⼯艺简单、产量⾼、周期短、⽣产成本低。然⽽，许多蛋⽩质在翻译后，需经过翻译后的修饰加⼯，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋⽩酶⽔解等过程才能转化成活性形式。⼤肠杆菌缺少上述加⼯机制，不适合⽤于表达结构复杂的蛋⽩质。另外，蛋⽩质的活性还依赖于形成正确的⼆硫键并折叠成⾼级结构，在⼤肠杆菌中表达的蛋⽩质往往不能进⾏正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋⽩，就需要进⾏变性溶解及复性等操作，这⼀过程⽐较繁琐，同时增加了成本。

⼤肠杆菌是⽤得最多、研究最成熟的基因⼯程表达系统，当前已商业化的基因⼯程产品⼤多是通过⼤肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量⾼、易于操作。但⼤肠杆菌是原核⽣物，不具有真核⽣物的基因表达调控机制和蛋⽩质的加⼯修饰能⼒，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应⽤。近年来，以酵母作为⼯程菌表达外源蛋⽩⽇益引起重视，原因是与⼤肠杆菌相⽐，酵母是低等真核⽣物，除了具有细胞⽣长快，易于培养，遗传操作简单等原核⽣物的特点外，⼜具有真核⽣物时表达的蛋⽩质进⾏正确加⼯，修饰，合理的空间折叠等功能，⾮常有利于真核基因的表达，能有效克服⼤肠杆菌系统缺乏蛋⽩翻译后加⼯、修饰的不⾜。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利⽤。［1］。

同时与⼤肠杆菌相⽐，作为单细胞真核⽣物的酵母菌具有⽐较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加⼯修饰能⼒。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分⼦遗传学⽅⾯被⼈们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第⼀个外源基因----⼲扰素基因［2］，随后⼜有⼀系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。⼲扰素和胰岛素虽然已经利⽤酿酒酵母⼤量⽣产并被⼴泛应⽤，当利⽤酿酒酵母制备时，实验室的结果很令⼈⿎舞，但由实验室扩展到⼯业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒⾼拷贝数的选择压⼒消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是⾼效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室⽤培养基成分复杂且昂贵，当采⽤⼯业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等⼈最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第⼆代酵母表达系统［10］。