分子印迹技术及其在药物分析和残留检测中的应用杨亚军,李剑勇Þ(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院新兽药工程重点室,甘肃兰州 730050)摘要:分子印迹聚合物是人工合成的对给定化合物及其结构类似物有着特异选择性的理想材料,其作为一种选择性吸附剂在对映体或立体异构体分离、固相萃取、化学传感器和模拟生物传感器及催化生物反应工程等方面应用十分广泛。本文简要介绍了分子印迹技术的原理、分子印迹聚合物合成的一般过程;同时综述了分子印迹技术在氯霉素、克仑特罗和氟喹诺酮类等药物分析和残留检测中的应用及发展趋势。关键词:分子印迹技术;药物分析;残留检测中图分类号:S859184 文献标识码:A 文章编号:0529-5130(2009)04-0101-05 分子印迹技术(molecularimprintingtechnology,MIT)也称为分子烙印技术,是源于人们对抗体-抗原或酶专一性的认识,合成对模板分子具有特定识别能力的聚合物的技术,是近二十年来出现且发展迅猛的一种高选择性分离技术。由于MIT模仿了生物界的锁匙作用原理,使制备的具有记忆功能的分子印迹聚合物(molecularimprintingpolymers,MIPs)拥有极高的选择性、很好的物理和化学稳定性,能够抵抗很强的机械作用力,在高温、高压、酸、碱、高浓度离子及有机溶剂等各种恶劣条件下也能保持其原有的特性;能反复使用达100次之多,在室温下保藏8个月而烙印能力未见衰减,因而受到广大研究人员的极大重视。在许多相关领域,如手性拆分固定相、固相萃取、膜分离、模拟抗体的免疫分析,人造酶体系、化学或生物传感器,催化剂和组合化学筛分等,得到了越来越广泛的应用。本文将就其基本原理以及在(兽)药物分析及残留检测中的应用进行综述。1 MIT概述MIPs的制备过程大致为:(1)将模板分子(template)和功能单体(functionalmonomers)按照一定比例混合后在一定条件下反应,通过共价键或非共价键作用形成可逆的模板分子-功能单体复合物;(2)加入交联剂等,使之与前面的模板-功能单体复合物通过聚合反应形成多孔性的高聚物;(3)将模板分子从高聚物中抽提出来,这样在聚合物的骨架上便留下了一个对模板分子有/预定(predetermined)0选择性的分子识别位。分子烙印聚合物中的空腔和模 收稿日期:2008-09-26基金项目:国家自然基金项目(30771590)。作者简介:杨亚军(1982-),男,研究实习员,硕士。*通讯作者。板分子形状、大小完全一样,从而实现对模板分子的特异性识别。根据模板分子和功能单体形成复合物时作用力的性质,MIPs分为共价型和非共价型两种[1]。此外,还有一种将这两种模式综合在一起的技术,即聚合时功能性单体与模板分子间的作用力是共价键,而在对印迹分子的识别过程中,二者之间的作用力是非共价键。Whitecombe等[2]将胆固醇与功能性单体4-乙烯基苯基碳酸酯(4-vinylphenylcarbonateester)共价结合后,用碱水解时随着CO2的释去而打开了单体和烙印分子间的共价键,此时MIP上便产生了一个非共价型的分子识别位,在分子识别中通过氢键结合胆固醇。用这种方法已经制备了体积较大底物(如药物分子、类固醇、糖类等)的分子印迹聚合物,这些聚合物具有多位(multiplesites)结合的结构。2 模板分子、功能性单体及聚合条件的选择MIPs形成中经过的两大步骤是两个相反的过程,它要求模板分子既能参加聚合反应,又能提取出来。作为模板的分子都应含有形成弱相互作用力或可逆共价键的基团,能满足要求的化合物主要有糖类(包括甘露糖、半乳糖、果糖)、氨基酸及其衍生物,蛋白质、核苷酸及其衍生物,嘌呤、嘧啶等生物碱,羧酸、二醛、胆固醇、维生素、酶、神经递质如乙酰胆碱,杀虫剂、除草剂、染料、药物以及重金属等。功能单体的选择主要由模板分子决定,首先必须能与模板分子成键,且在反应中它与交联剂分子处于合适的位置,能使模板分子恰好镶嵌其中。常用的功能性聚合单体有甲基丙烯酸(Methacrylicacid,MAA)、4-乙烯苯基硼酸、吡啶衍生物、丙烯酰胺(Acrylamide)等等。一般认为MAA与氨基之间可发生质子化作用,同酰基、羧基、氨基甲酸酯之间可产#101#畜牧与兽医 2009年 第41卷 第4期生氢键作用。为得到稳定的模板-单体复合物,所选择的功能单体应与模板间存在尽可能强的分子间作用力(如氢键、离子对作用等),因此对含有碱性官能团(如氨基等)的模板应选择含羧基的功能单体(MAA等);而含酸性功能基团(如羧基、酚羟基)的模板应尽可能用碱性功能单体如乙烯基吡啶。有时根据模板分子的结构,采用与模板分子具有多作用位点的功能单体,可使聚合物的选择性大大提高。此外,对某些模板分子采用混合功能单体,亦能提高分子印迹聚合物的选择性。Jorge[3]在研究氯霉素分子印迹时采用混合功能单体,二乙氨基乙基丙烯酸甲酯(diethylaminoethylmethacrylate,DAM)与2-乙烯基吡啶摩尔比是25B75,混合功能单体与氯霉素的摩尔比为2B1,在50e条件下,制备的氯霉素分子印迹聚合物,试验结果表明混合功能单体聚合物的印迹效果优于单一功能单体;Wang等[4]在研究氨基酸衍生物分子印迹时,2-乙烯吡啶和丙烯酰胺的混合物为功能单体,也得到了类似的结果。交联剂最常见的主要是乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethyleneglycoldimethacrylate,EDMA)、季戊四醇三丙烯酸酯以及一些乙烯基衍生物,如二乙烯基苯等。分子印迹过程主要通过自由基引发,其引发方式主要有高温热引发和低温光引发。具体的聚合条件选择则视具体情况而定,因为影响反应的因素很多,如浓度、温度、光照及溶剂的种类和极性等。常用的引发剂有偶氮二异丁腈(2,2c-azobis(isobutyron-itrile),AIBN)、偶氮二异庚腈(2,2c-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile),ADVN)等。非共价作用的强弱强烈地依赖于溶液的极性,所以非共价方式一般选择在有机溶液如氯仿、甲苯中进行,而共价方式一般选择在极性较强的水、醇等溶液中进行。3 MIT在药物分析和残留检测中的应用分子印迹聚合物以其特有的优势,在亲和分离(主要包括色谱分离、膜分离、固相萃取等)、仿生传感器、模拟酶、抗体结合模拟等领域得到了广泛的应用。以下主要就MIT在禁用/限用药物分析和残留检测中的应用进行综述。311 氯霉素氯霉素(chloramphenico,lCAP)是国际上第一个被禁止用于食用性动物饲养的抗生素,它能导致人体产生严重的再生障碍性贫血和致命的/灰婴综合征0。世界各国对CAP的残留检测都有着及其苛刻的规定。但目前各国对动物源性食品中CAP的检测限已达普通仪器的检测极限,加上食品基质复杂,所需提取净化步骤多,对其进行测定不但昂贵,而且繁琐费时。MIPs具有形状和化学功能基团与模板分子互补的大孔立体空穴,对模板分子呈现预定的选择性和高度的识别性能。将其用于CAP的残留检测,能有效富集样品中的CAP,减少生物样品中复杂成分的干扰,从而有利于减少对色谱仪器的污染和提高检测方法的灵敏度。以合成的氯霉素-甲基红共轭物为模板,Scott等[5-6]选用二乙胺基乙基甲基丙烯酸酯为功能单体,制备了MIPs,该MIPs可重复能力强,能快速高效地检测CAP,对甲砜霉素也有一定的识别检测能力;试验结果表明,该MIPs与HPLC联用,在3~1000Lg/mL浓度范围内,线性关系良好,完全可以用于分析血浆中CAP的含量。张燕等[7]以CAP为模板分子,4-乙烯吡啶为功能单体,EDMA为交联剂,AIBN为引发剂,四氢呋喃为致孔剂,模板分子、功能单体、交联剂比例为1B1B10,所制备的MIPs对CAP的特异性吸附达54142Lmol/g,可在10min内快速达到吸附平衡。陈小霞[8]以MAA为功能单体,EDMA为交联剂,AIBN为引发剂,最佳聚合条件为:CAP与功能单体及交联剂的摩尔比例为1B2B20,四氢呋喃为致孔剂,聚合温度为50e,制备了CAP分子印迹固相萃取(molecularlyimprintedso-lid-phaseextraction,MISPE)柱,并通过对其吸附能力、解吸条件等特性的研究表明,与目前CAP检测中所采用的传统C18柱相比,CAP-MIP固相萃取柱可采用甲醇含量较高的甲醇/水混合溶剂作为淋洗溶剂,用乙腈含量为40%(体积分数)的乙腈/水作为洗脱溶剂,且比传统C18柱具有更大的柱容量。在生物样品的检测中,MIT与普通的检测方法联用后,样品的前处理过程简化,方法的回收率和精密度大大提高。Christina[9]制备的CAP-MIPs对CAP标准溶液的回收率接近100%,蜂蜜样品中CAP的回收率也达94%以上。Shi等[10]以水悬浮法制备了CAP分子印迹微球,并以此微球制备了MISPE柱,以富集牛奶及虾等样品中的CAP残留,回收率分别为9217%和8419%,也使HPLC-UV对牛奶和虾中CAP的检测灵敏度提高到5Lg/kg。Mena等[11]以二乙胺基乙基甲基丙烯酸酯为功能单体,合成CAP-MIP,建立了牛奶中CAP的分子烙印固相萃取-方波循环伏安法的检测方法。结果表明在917~312mg/L的浓度范围内,线性关系良好,回收率高;该方法准确、高效,同时简化了其他方法中较为繁琐的样品处理步骤。Brian等[12]制备的CAP-MIP固相萃取柱,与LC-MS/MS联用,可以从蜂蜜、尿液、牛奶和血浆等样品中萃取出CAP,避免其他杂质的干扰,该方法完#102#AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine 2009 Vol141 No14全可以满足欧盟对CAP的残留检测规定。312 B-受体兴奋剂类药物克仑特罗(clenbutero,lCL)为B-受体兴奋剂类药物,检测方法主要有固相萃取和免疫亲和技术,结合HPLC、GC-MS以及HPLC-MS等[13-15]。但是上述方法的样品处理步骤均较为繁琐,且容易产生严重的基体干扰。Emile等[16]制备了CL-MIPs和空白MIPs包裹的硅纤维,评价吸附特性的试验结果表明,在pH710的磷酸盐缓冲液中,两者对克仑特罗类似物波洛母特罗(brombuterol)的萃取率均约为80%,但在乙腈中,前者的萃取率为75%,而后者仅为5%;CL-MIPs包裹硅纤维对乙腈和磷酸盐缓冲液中10ng/mL和100ng/mL浓度的波洛母特罗,在30min内可以达到吸附平衡,而空白MIPs则需要90min;进一步试验表明,CL-MIPs可以在乙腈和磷酸盐缓冲液中萃取5种克仑特罗结构类似物。瑞典的MIPTechnology公司是将MISPE产业化的先驱,他们开发了针对B-受体激动剂的MISPE装置[17-18],可从牛尿液样品中萃取CL,线性范围为015~100Lg/L,准确度好(016Lg/L回收率为9617%,610Lg/L时回收率为9617%),精密度高(016Lg/L时RSD为413%,610Lg/L水平下的RSD为211%),用HPLC-UV检测尿样,可获得015Lg/L的检测限。国内王培龙等[19]采用MIPTechnology公司的MISPE小柱提取、净化并富集猪尿液中的CL,经N,O-双三甲基硅基三氟乙酸胺(BSTFA)衍生化以后,毛细管气相色谱-质谱联用测定;在优化条件下,该方法的检出限为0151Lg/L,定量限为1100Lg/L,不同CL加入量的回收率为7110%~8913%;RSD为312%~917%。结果表明该方法灵敏度和精密度高,操作更为简单、快捷。Christine等[20]也报道了可用于多种B-受体兴奋剂类药物残留提取的MI-SPE,牛尿液样品由该MISPE处理后,萃取物由LC-MS进行测试,离子阱检测器,平均回收率分别为:盐酸克仑特罗5210%,妥洛特罗3816%,异克舒林3415%,波洛母特罗5417%,马布特罗4118%,沙美特罗6310%和莱克多巴胺6416%;添加浓度为0125ppb时的RSD小于11%;其检测限为从马布特罗的0101ppb到沙美特罗的0119ppb。Gianfranco等[21]制备的CL-MIPs对动物饲料及生物样品(尿液、肝脏等)中的CL及其结构类似物都有很好的印迹效果。Kootstra等[22]制备了B-受体激动剂分子印迹聚合物,将其与液相色谱-离子阱质谱联用,对经过消化、水解、除脂后的牛肉样品中B-受体激动剂的最低检测浓度可达1Lg/kg,该方法也同样适用于其他动物肌肉中B-受体激动剂类药物的检测。313 氟喹诺酮类药物近年来,氟喹诺酮类(fluoroquinolones,FQs)的不良反应和耐药性的报道越来越多,其潜在的严重不良反应逐渐受到了人们的高度关注。韩国学者Yan等[23]在水-甲醇体系中制备了环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)分子印迹聚合物,以此为HPLC柱填充材料,尿样在离心后,通过调节流动相pH,可以很容易的除去样品中的其他干扰检测的杂质;其自制的色谱柱,CIP在011~100mg/L的浓度范围内,线性关系良好,r=019993,RSD小于316%,最低检测限为0103Lg/mL,3个不同浓度的回收率大于9415%;另外,当进样量由510LL提高到210mL时,其检测限提高100倍以上。以MAA为功能单体,Esther等[24]制备了CIP-MIPs,试验结果表明,其可以识别出FQs和喹诺酮。以此CIP-MIPs为HPLC填充材料,检测土壤样品中的FQs,检测限可以达到015Lg/g。Xu等[25]通过疏水和静电作用,以双甲基丙烯酰氧-B-环糊精和二乙氨基乙基丙烯酸甲酯为功能单体,合成了诺氟沙星MIPs。结果表明,该聚合物在水溶液中对诺氟沙星有高的结合特性和选择性。曹玺珉[26]、连宁[27]等分别制备了CIP-MIPs和伊诺沙星MIPs,运用平衡结合试验研究了印迹聚合物的吸附特性和选择识别能力。Scatchard分析表明,在所研究的浓度范围内,聚合物中形成了两类不同的结合位点;底物选择试验表明,其分别对CIP和伊诺沙星呈现高的选择结合能力。刘占理等[28]的结果也表明,CIP-MIPs微球同样对CIP有高的选择吸附性和再生性,可用于CIP的分析和分离。将CIP、MAA和三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯(TRIM)按照1B6B16的比例,刘芃岩等[29]制备了CIP-MIPs,结果表明,其具有良好的吸附能力和吸附选择性,静态吸附分配系数KD为41164,分离因子A为1162;该印迹聚合物中形成了2类不同的结合位点,经计算它们的离解常数分别为Kd1和Kd2分别为51249@10-5mol/L和21237@10-3mol/L。郭洪声等[30]试验表明,氟哌酸MIPs中MAA与氟哌酸之间通过离子作用和氢键作用形成两类结合位点,对氟哌酸呈现出高的选择结合特性;该聚合物热稳定性强、机械稳定性高且可长期使用。以聚偏氟乙烯中空纤维超滤膜为支撑膜,左氧氟沙星为模板分子,邴乃慈等[31]采用热聚合方法制备了分子印迹聚合物膜,并以此固相萃取选择性分离氧氟沙星外消旋体。试验结果表明:分子印迹聚合物膜#103#畜牧与兽医 2009年 第41卷 第4期
