原生质体的分离和培养
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植物原生质体的分离及融合
植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。
细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。
2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。
本实验用PEG诱导原生质体融和。
PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。
PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。
当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。
Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。
高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。
PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。
二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。
（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。
（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。
（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。
实验六植物原生质体的分离和培养
实验六植物原⽣质体的分离和培养实验六植物原⽣质体的分离和培养⼀．教学⽬标：了解植物原⽣质体作为细胞⼯程研究的重要意义，了解原⽣质体活性鉴定的原理。
掌握分离和培养原⽣质体的技术、⽅法和原理。
掌握细胞活性的检测⽅法。
掌握细胞计数的原理和⽅法。
⼆．重点：掌握分离和培养原⽣质体的技术、⽅法和原理。
掌握细胞活性的检测⽅法。
掌握细胞计数的原理和⽅法。
三．难点：分离和培养原⽣质体的技术。
四．授课⽅式与教学⽅法：讲解原理、实验操作⽰范或具体指导。
五．教学内容:实验原理植物原⽣质体(protoplast)是除去细胞壁后为原⽣质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。
其中,酶解法分离原⽣质体是⼀个常⽤的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因⽽使⽤纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原⽣质体。
由于原⽣质体内部与外界环境之间仅隔⼀层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原⽣质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常⽤⽢露醇或蔗糖，酶液还应含⼀定Ca2+来稳定原⽣质膜。
其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原⽣质体的影响。
将原⽣质体接种在培养基上进⾏培养，细胞壁再⽣，细胞分裂和再⽣植株。
测定原⽣质体的活性有多种⽅法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染⾊是常⽤的⼀种⽅法,FAD 本⾝⽆荧光,⽆极性,可透过完整的原⽣质膜。
⼀旦进⼊原⽣质体后,由于受到酯酶分解⽽产⽣具有荧光的极性物质荧光素。
它不能⾃由出⼊原⽣质膜,因此有活⼒的细胞能产⽣荧光,⽆活⼒的原⽣质体不能分解FAD⽆荧光产⽣。
细胞计数⼀般⽤⾎细胞计数极，按⽩细胞计数法进⾏计数。
从理论上讲，植物体的任何⼀部分都可以通过酶解作⽤去除细胞壁⽽得到原⽣质体。
但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。
所以，为了制备健康的原⽣质体，⼀般选⽤根尖、茎尖、嫩叶及对数⽣长期的愈伤组织为材料，⼀旦细胞具有⽊质化或次⽣加厚的外壁，则不能被酶降解。
原生质体无菌分离培养与融合
然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。由于比重不同， 蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界 面). (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚 集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界 面处，
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
植物原生质体培养
原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。
然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
原生质体的分离、融合与培养
大连理工大学
• PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效 应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质 体融合得以完成。
• PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水 化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可作为邻近原 生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可 在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接 在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从 而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高 了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
环境与生命学院
– 实验材料：黄瓜种子。
– 实验用品： ①实验器具：三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解 剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤 器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、 超静工作台。
大连理工大学
②试剂：
环境与生命学院
(1)酶液
(2)PEG融合液
(3)13％CPW洗液
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环境与生命学院
实验十二 原生质体的分离、 融合与培养
指导教师：唐颖
大连理工大学
环境与生命学院
1.实验目的
• 了解植物原生质体分离、融合和培养的基 本原理。
• 掌握植物原生质体分离、融合和培养的基 本过程。
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环境与生命学院
2.实验原理
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环境与生命学院
概述
• 物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义， 它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为 作物改良的有力工具之一。
原生质体的分离与融合
原生质体融合技术体系大致包括三大环节：
02
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
诱导原生质体融合
03
杂种植株的再生与鉴定
选择融合体或杂种细胞
(一) 原生质体融合
原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。 自然融合（Spontaneous fusion） 来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。
2.酶法
原生质体的分离
01
二、影响原生质体分离的因素
01
原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透
02
压、酶解时间、温度等。
03
组织和细胞材料的生理状态
04
植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体
05
的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很
06
容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应
添加标题
质杂种。
体细胞杂交
物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。
01
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01
体细胞杂种的应用
一、体细胞杂种的应用潜力
添加标题
植物育种中的核质替换
添加标题
细胞质杂种的获得
添加标题
远缘杂交创造新物种
02
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诱导原生质体融合
03
杂种植株的再生与鉴定
选择融合体或杂种细胞
(一) 原生质体融合
原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。 自然融合（Spontaneous fusion） 来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。
2.酶法
原生质体的分离
01
二、影响原生质体分离的因素
01
原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透
02
压、酶解时间、温度等。
03
组织和细胞材料的生理状态
04
植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体
05
的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很
06
容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应
添加标题
质杂种。
体细胞杂交
物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。
01
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
01
体细胞杂种的应用
一、体细胞杂种的应用潜力
添加标题
植物育种中的核质替换
添加标题
细胞质杂种的获得
添加标题
远缘杂交创造新物种
第五章 植物原生质体的分离与培养
八. 原生质体融合
（二）杂种细胞的选择与细胞杂种的鉴定 1. 杂种细胞的选择方法 （1）培养基促进异核体生长的选择方法 （2）叶绿素缺失互补选择法 （3）机械分离，肉眼分辩法 （4）双突变系选择法 （5）荧光标记选择法
八. 原生质体融合
2. 体细胞杂种的鉴定
这种鉴定不但在于确认细胞杂种的杂种
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
（一）原生质体融合的方法 1. 无机盐诱导融合 用来做融合剂的无机盐是硝酸钠，1972年
Carlsony就是用它来融合烟草的原生质体，并 首次获得种间的体细胞杂种。其原理是硝酸钠 的作用是中和了质膜的负电荷，使原生质体不 再相互排斥，而紧密结合在一起，但硝酸钠对 原生质体有害作用，且诱导频率也很低，所以 目前很少有人采用。
二. 植物原生质体的基本特点与作用
5.植物原生质体为研究细胞壁的生物合成
提供了方便。 6.植物原生质体为研究细胞膜与信息的传 递，能量的转换，物质的运输等基本现 象之间的密切联系提供了可能。 7.植物原生质体不但是良好的受体，同时 又是分离细胞内各种细胞器，如细胞核、 叶绿体、线粒体等的好材料。 见图1：
融合技术要点：
P1 P2
混合静止1min
P1 P2
加入PEG
选 择
培 养
高Ca2+高pH
加入培养基
融 合
洗 涤
电场下形成原生质体凝聚体
八. 原生质体融合
3. 电融合技术
就是使用电融合仪，其优点在于避免了
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备：解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。
常用的解离液包含酶类，如纤维素酶和果胶酶，它们能够分解植物细胞壁。
根据不同植物材料的特性，调整酶液的浓度和pH值，确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。
原生质体的分离与纯化：解离后，将混合液通过筛网过滤，以去除未解离的细胞碎片。
然后，将过滤后的液体转移到离心管中，以低速离心收集原生质体。
使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体，去除细胞碎片和其他杂质。
二、原生质体的培养培养基的选择与准备：原生质体的培养需要合适的培养基，通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。
培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。
培养基在使用前需要经过高压灭菌，以确保无菌条件。
原生质体的接种：将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。
对于固体培养基，可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。
对于液体培养基，则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。
接种后，培养基应保持无菌环境，并在适宜的温度和光照条件下进行培养。
培养环境的控制：原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。
一般情况下，原生质体的培养温度为2528℃，光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。
保持适宜的环境条件，有助于原生质体的生长和分化。
三、原生质体的再生诱导再生：在适宜的培养条件下，原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。
根据不同植物的需求，可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂，如细胞分裂素、赤霉素等，以促进愈伤组织或芽的形成。
转化与选择：对于转基因实验，可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。
转化后的原生质体应在选择培养基上培养，以筛选出成功转化的细胞。
选择培养基通常含有抗生素，以筛选含有抗性基因的细胞。
分化与生根：成功转化的细胞在培养基中继续生长，并开始分化为完整的植物组织。
此阶段通常需要切换到生根培养基，以促使愈伤组织或芽生根。
实验九 植物原生质体的分离和培养
实验九植物原生质体的分离和培养实验目的掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。
实验原理原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。
在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。
植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。
分离愿生厦籀萨采用酶解法。
其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。
原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。
酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。
游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。
实验用品一、材料1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。
2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。
二、器材超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细胞计数板、石蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器(5、10m1)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10ml，上部管口加棉塞)、培养皿(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。
三、试剂1. 70％酒精。
2. 0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen 80。
3. 灭菌蒸馏水。
4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。
5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。
6. 酶液A纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10 2％果胶酶(13ectinase，Serva) 1 %(若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。
原生质体的分离和培养
时间 30min-------20h
4.木、草本植物使用时间不同
5.时间 4~24h 1g材料+10ml
二 原生质的培养
1.过程:原生质---细胞再生---细胞分裂--细胞团芽和根
2.培养方法
细胞植板法 半固体培养基 琼脂糖
优点:位置固定,方便观察 琼脂上细胞不易分裂 可降低渗透压
多用液体培养基: 可更换培养基 可降低细胞密度
----胚状体---植物
方法:(1)原生质悬浮液0.5ml,置于10mm×100mm的小 管中;
(2).加入贮于00C,含2mg/L的 FDA的丙酮溶液成 质量分数为0.01%,混匀;
(3).置于室温下5min后
用荧光显微镜观察
有活力: 荧光 无活力:无荧光
2.检测细胞壁是否除净荧光增白剂
用荧光显微镜观察 培养基
有细胞壁 绿色荧光
无细胞壁:红色
将纯化后收集的原生质加入0.1%--0.05%的荧光增
白剂,染色5~10min.离心3min,再用0,7mol/L甘露洗去
多余染料,如此重复3次.
1.营养成分 无机盐 有机物
激素
条件培养基:将生长迅速的细胞在液体培养基中培 养一段时间,除去细胞后收集的培养基.
Ph值 5.6~5.8
2.原生质体的培养方法
2.酶解:
苄烷铵0.1%+酒精10%-- 5min 01
1.表面消毒:
60%~70%酒精消毒30s--- 0.1%HgCl2- 无菌水冲洗 3~5次 02 撕去叶片下表皮(向下)--- 漂浮于酶液中----------------纤维素酶:消化细胞壁纤维素
酶的选择: 静止 轻摇 易获得 酶处理简便
酶解法:漆斑霉产生的纤维素酶(粗制剂)---分离番茄根尖 细胞原生质体
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第十一章原生质体的分离和培养1 引言植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术，它是20世纪60年代初，人们为了克服植物远缘杂交的不亲和性，利用远缘遗传基因资源改良品种而开发完善起来的一门技术。
植物原生质体是遗传转化的理想受体，能够比较容易地摄取外来遗传物质，如外源DNA、染色体、病毒、细胞器等，为高等植物在细胞水平或分子水平上的遗传操作提供了理想的实验体系。
原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。
就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。
1960年英国植物生理学家Cocking首次利用纤维素酶等从番茄根细胞分离原生质体获得成功。
1971年Takebe等培养烟草叶片原生质体获得再生植株，首次证实了原生质体的全能性。
1972年美国科学家Carl．son等利用细胞融合技术，首次获得两种不同烟草原生质体融合的体细胞杂种。
1974年高国楠等开发出了PEG（聚乙二醇）融合方法。
1978年德国科学家Melchers等把马铃薯和番茄的原生质体进行融合，获得了体细胞杂种——马铃薯番茄。
1981年Zimmermann开发出了高压脉冲法，即电融合技术。
植物原生质体培养和细胞融合技术已经成熟，并成为品种改良和创造育种亲本资源的重要途径。
迄今已在多种作物上获得了原生质体植株和种、属间杂种植株，也为细胞生物学、植物生理学及体细胞遗传学的研究做出了重要贡献。
第一节植物原生质体分离一、原生质体分离(一)植物细胞膜电特性和膜电位植物细胞膜是一个由脂类和蛋白质等构成的双层分子层膜，其物理性质类似于一个双电层，细胞的内外层带的是同种电荷。
不同植物的细胞膜电位不同，同种植物细胞倍性不同以及在不同外界离子环境下，其细胞膜的膜电位也不同(表7-1、表7-2)。
了解植物细胞膜的电特性对细胞融合的研究很有-必要。
原核生物遗传饰变过去几十年取得了很大进展，转导和转化现已成为对微生物进行遗传操作的标准方法。
利用微生物进行遗传操作研究的优点是：①这些单细胞和单染色体系统既简单又容易控制；②它们的复制周期很短。
在真核生物中将遗传物质由一个个体转移给另一个个体的传统方法是有性杂交，它所能进行的范围极为有限，尤其在动物中是这样。
就是在植物中，虽然远缘杂交并非不可能，但由于有性不亲合性的障碍，有时在选定的亲本之间也难以获得完全的杂种(见第9章和第10章)，这是通过杂交进行作物改良的一个严重障碍。
在这点上细胞融合为远缘杂交提供了一个很有潜力的新途径(体细胞杂交)。
无论是在植物中还是在动物中，细胞融合必须穿越质膜才能完成。
植物与动物不同，在质膜之外还有一层坚硬的纤维素壁，相邻的细胞被一层主要由果胶质构成的基质粘连在一起。
主要由于这个原因，体细胞遗传学在动物中的发展远远超过了在植物中的发展。
只是自1960年以来，由于Cocking证实了通过酶解细胞壁可以获得大量有活力的裸细胞(原生质体)，对高等植物体细胞遗传饰变的真正兴趣才与日俱增。
实际上，这一领域的研究甚至是更晚——1970．年以后——才活跃起来的。
高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究以外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。
原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。
通过原生质体系统对植物细胞进行遗传饰变方法的要点是：①原生质体的分离；②培养原生质体并使之再生完整植株；⑧细胞融合；④把外源遗传物质、细胞器或微生物导人原生质体。
本章讨论原生质体分离和培养的技术，现将其主要环节示于图11．1，与体细胞杂交有关的细胞融合和离体原生质体在其他方面的应用将在第12章中讨论。
图11．1 叶肉原生质体的分离、培养和植株再生(71自Bajaj，1977)11．2原生质体的分离11．2．1原生质体分离的方法11．2．1．1机械法由高等植物中分离原生质体的研究最早是Klercker在1892年进行的。
当时他所用的主要是机械法—把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割。
在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。
在某些贮藏组织中，如洋葱的鳞片、萝卜的根、黄瓜的中皮层、甜菜的根组织等，应用这个方法可由它们高度液泡化的细胞中分离出原生质体。
然而，这个方法有明显的缺点：一是产量很低，二是在由分生细胞和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不适用。
11．2．1．2酶解法1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。
他使用了一种由疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液以降解细胞壁。
然而，进一步的研究只是到了有商品酶供应之后才成为可能。
自从1968年纤维素酶和离析酶投入市场以后，植物原生质体才变成了一个热门的研究领域。
首先用商品酶进行原生质体分离的是Takebe等(1968)。
在他们分离烟草叶肉原生质体的程序中，上述两种酶是依次使用的，即先用离析酶处理叶片小块，使之释放出单个细胞，然后再以纤维素酶消化掉细胞壁，释放出原生质体。
Power和Cocking(1968)证实，这两种酶也可一起使用。
这种“同时处理法”或“一步法”比“顺序处理法”快，并且由于减少了步骤，从而减少了微生物污染的机会。
多数研究者现在都使用这种简化的一步法，这种方法的细节见附录11．1。
现在市面上有各种酶制品出售(表11．1)．取决于组织性质的不同，它们可以不同配比搭配使用。
表11．1 存厦毕后佐分离审常用的商品醢由于商品酶的出现，现在实际上已有可能由每种植物组织分离出原生质体，只要该组织的细胞还没有木质化即可。
据报道，由以下各种组织中都已分离出原生质体：叶肉细胞，根组织，豆科植物的根瘤，茎尖，胚芽鞘，块茎，花瓣，小孢子母细胞，果实组织，糊粉细胞，下胚轴和培养的细胞等。
有活力和适于培养的原生质体的大量分离受到若干因素的影响，一个实验体系所需的最适条件主要是靠经验确定的。
在想用一个新的实验系统分离原生质体时，可以参考Uchimiya和Murashige(1974)在烟草培养细胞上所做的工作，和Scott等(1978)在禾谷类植物叶肉组织上所做的工作(见表11．2)。
表11．2在两个物种中原生质体分离的最适条件①引自Uchimiya和Murashige(1974)；②引自Scott等(1978)。
由叶肉细胞分离原生质体的方法见附录11．1(同时见图11．2)。
图11.2 分离叶肉原生质体的技术流程(引自E．C．Cocking) 11．2．2影响原生质体产量和活力的因子11．2．2．1材料来源植物原生质体最方便和最普遍的来源是叶片，因为由叶片中可以分离出大量的比较均匀一致的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。
由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。
当由叶片制备原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要。
为了能在最大程度上控制供体植株的生长条件，一些作者使用了离体培养的植物，对这些植物的叶片无须进行表面消毒。
不过多数作者还是使用温室或生长室栽种的植物，在这种情况下，一般以生长在下述条件下的植株能产生较好的结果：低光照强度(1 000 μW／cm2。
)，短日照，温度范围20～25℃，相对湿度60％～80％，以及充足的氮肥供应。
由于从禾本科和其他一些物种的叶肉细胞分离适于培养的原生质体相当困难，因此在这些植物中一直用培养细胞作为供体材料。
培养细胞的原生质体产量取决于这些细胞的生长速率和生长时期。
频繁继代(每3 d一次)的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞，是最适宜的供体材料。
11．2．2．2前处理由生长在非无菌条件下的植株上取来的组织，首先必须进行表面消毒。
一般来说，消毒方法与第2章中介绍的用于组织和器官培养的消毒方法相同。
根据Scott等(1978)的实验结果，对禾谷类植物叶片进行表面消毒时，效果最好效率最高的方法是把它们用苄烷铵(Zephiran)(O.1％)一酒精(10％)溶液漂洗 5 min。
叶片表面消毒的另一种方法是用60 9／6～70％的酒精漂洗，然后再在超净工作台上使叶表面的酒精蒸发掉。
要保证酶解能充分进行，必须促使酶溶液渗入到叶片的细胞间隙中去，为达到这个目的可以采用几种不同的方法，其中应用最广泛的方法是撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使叶片飘浮在酶溶液中。
如果叶片的下表皮撕不掉或很难撕掉，则可把叶片或组织切成小块(约1 mm。
)，投入到酶溶液中。
若与真空渗人相结合后，后一种方法不但十分方便，而且也非常有效。
据Scott等(1978)报道，若以真空处理3～5 rain，使酶溶液渗入叶片小块，在2 h内即可把禾谷类植物的叶肉原生质体分离出来。
检查酶溶液是否已充分渗入的标准，是当真空处理结束后大气压恢复正常时叶片小块能否下沉。
代替撕表皮的另一种有效方法是用金刚砂(246目)摩擦叶的下表面。
在酶处理期间进行搅拌或振动可以增加培养细胞的原生质体产量。
11．2．2．3酶处理原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度。
分离植物细胞原生质体所必需的两种酶是纤维素酶和果胶酶，后者的作用主要是降解中胶层，前者是消化细胞壁纤维素。
市售的最早真菌酶制品是Onozuka纤维素酶SS和Onozuka离析酶SS，这两种酶一直得到了广泛的应用。
由于对这类酶的需求与日俱增，现在又有其他很多公司进行这类酶的生产(见表11．1)。
崩溃酶同时具有纤维素酶、果胶酶、地衣多糖酶和木聚糖酶等几种酶的孵解活性，对于由培养细胞中分离原生质体特别有用。
即使是纯化的酶，如纤维素酶R－10，看来也含有相当数量的果胶酶。
果胶酶Y一23是一种效力很高的离析酶，若与纤维素酶结合使用，可在30 min内由豌豆叶肉细胞中把原生质体释放出来。
对于某些组织来说，除了纤维素酶和离析酶之外可能还需要半纤维素酶。
大麦的糊粉细胞以纤维素酶处理之后并不能把原生质体释放出来，这是因为在原生质体周围还留下一薄层抗纤维素酶的壁。
这类细胞称作原生质球，只有用Glusulase酶处理才能把它们剩余的壁消化掉。
粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力可能是有害的。
因此有些研究者常在使用之前将这些酶纯化，方法是使它们通过聚丙烯酰胺凝胶或葡聚糖凝胶G25进行过滤洗提。
不过在多数情况下，这些酶的粗制形式也能产生令人满意的结果。
确实，Arnold和Eriksson(1976)观察到，酶的纯化会导致存活原生质体数目的减少，相比之下，粗制酶效果更好。
酶的活性与pH值有关。
按照生产厂家的说明，Onozuka纤维素酶R－10和离析酶R－10的最适pH值分别为5～6和4～5。