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1. 掌握溶菌酶活力测定的原理和方法；2. 熟悉分光光度计的使用；3. 了解溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。
二、实验原理溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能够催化某些细菌（革兰氏阳性菌）细胞壁多糖水解的酶，从而溶解细菌细胞壁，起到杀菌作用。
测定溶菌酶活力时，可用细菌细胞壁作为底物，细胞壁溶解后，菌悬液浊度降低，通过分光光度法测定菌悬液浊度变化，计算溶菌酶活性。
三、实验材料与试剂1. 试剂：1. 1mol/L氢氧化钠溶液；2. 1mol/L盐酸溶液；3. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）：NaHPO·2H2O 0.392g，溶于蒸馏水并稀释至1000mL，调节pH至6.2；4. 牛肉膏培养基；5. 溶菌酶结晶标准品（酶活力单位为70000U/mg）。
2. 仪器：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 移液器；4. 电子天平；5. 烧杯；6. 漏斗；7. 移液管。
1. 准备实验试剂和仪器；2. 配制0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）；3. 将枯草杆菌制成菌悬液；4. 将溶菌酶标准品稀释成不同浓度；5. 分别取不同浓度的溶菌酶标准品和菌悬液，加入反应体系中；6. 在分光光度计上测定菌悬液在450nm波长下的吸光度值；7. 根据吸光度值和溶菌酶标准品浓度，绘制酶活力曲线；8. 测定待测溶菌酶样品的酶活力。
五、实验结果与分析1. 酶活力曲线：根据实验数据，绘制酶活力曲线，结果表明酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系。
2. 待测溶菌酶样品的酶活力：根据酶活力曲线，计算待测溶菌酶样品的酶活力。
六、实验结论通过本实验，我们成功掌握了溶菌酶活力测定的原理和方法，熟悉了分光光度计的使用，并了解了溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。
实验结果表明，溶菌酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系，为后续相关研究提供了实验依据。
七、实验注意事项1. 实验过程中，注意控制反应体系的pH值，以保证溶菌酶活性；2. 使用分光光度计测定吸光度值时，注意选择合适的波长；3. 实验过程中，操作要规范，避免污染。
一、实验目的1. 了解溶菌酶的性质和特性；2. 掌握溶菌酶的提取和纯化方法；3. 学习溶菌酶的结晶技术；4. 鉴定溶菌酶的纯度和分子量。
二、实验原理溶菌酶（lysozyme）是一种广泛存在于生物体中的碱性蛋白质，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
溶菌酶能水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，导致细胞壁破裂，从而杀灭细菌。
本实验通过从鸡蛋清中提取溶菌酶，经过分离纯化后，采用硫酸铵盐析法进行结晶，并鉴定溶菌酶的纯度和分子量。
三、实验材料1. 实验仪器：高速离心机、冰箱、紫外可见分光光度计、显微镜等；2. 实验试剂：鸡蛋清、硫酸铵、NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、pH 7.0 Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE电泳试剂等；3. 实验耗材：离心管、玻璃棒、滤纸、试管、移液器、培养皿等。
四、实验步骤1. 溶菌酶提取（1）取鸡蛋清2g，加入20ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液，搅拌溶解；（2）加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（3）加入1mol/L CaCl2溶液，使CaCl2浓度达到0.1mol/L，搅拌30分钟；（4）加入1mol/L MgSO4溶液，使MgSO4浓度达到0.1mol/L，搅拌30分钟；（5）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液5ml，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到80%，搅拌30分钟；（2）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取沉淀；（3）将沉淀溶解于10ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中，加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（4）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液。
3. 溶菌酶结晶（1）取上清液5ml，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到80%，搅拌30分钟；（2）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取沉淀；（3）将沉淀溶解于5ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中，加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（4）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液；（5）将上清液置于冰箱中过夜，观察结晶现象。
本实验我们致力于研制出安全、有效的新型海洋溶菌酶，通过Ni-NTA介质纯化带有his标签的重组蛋白，并从pH、温度、金属离子、去垢剂和抑制剂等方面对海洋溶菌酶进行研究。
在实验过程中，出现了许多之前没有想到的难题，我们不断完善实验步骤，在这过程中收获了很多。
接菌和扩大培养的实验中要确保无菌操作，保证自己的菌液不会被污染。
在保菌的时候要控制甘油的浓度在15%~20%之间，甘油浓度太高会诱使菌种产生变异。
诱导剂的量要严格把控，诱导剂的含量过低会使得扩大培养的菌液诱导不充分最后纯化出的蛋白含量低，诱导剂含量过高会使得菌液诱导过度导致最后纯化出的蛋白中含有很多杂蛋白。
配胶的时候玻璃板一定要清洗干净，否则配出的胶会有很多气泡，一定要先配分离胶再配浓缩胶，顺序不能颠倒，配好分离胶后要用蒸馏水或者乙醇液封，保证分离胶上边水平。
染色时开始用快染法发现效果不好，导致蛋白条带不清晰，换用考马斯亮蓝R-250染色会好很多。
在测量酶活的实验过程中发现用溶壁微球菌菌粉配置菌液在后续的测量中会出现菌粉沉降影响实验结果的现象，后来换用LB培养基培养出来的溶壁微球菌菌液再测量的时候测量数值就比较稳定，没有在出现吸光度一直下降的现象。
实验中还发现虽然使用酶标仪测酶活的时候用的蛋白样品比较少且操作简单快捷，但是误差要比分光光度仪的误差大很多。
试验中出现过菌液加入溶菌酶蛋白后吸光度没有下降反而上升的现象，经过思考得知可能是由于自己的蛋白样品浓度较低，而且样品本身也有一定的吸光度，可能是由于一开始加入溶菌酶后溶菌酶与菌液反应时间过短所以导致菌液加入溶菌酶蛋白后吸光度没有下降反而上升，解决方法是把蛋白样品超滤提高样品浓度，并且增加菌液和溶菌酶的反应时间。
这次实验中我学习了很多相关的原理知识，学会了使用高速离心机、超声细胞波破碎仪、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳设备、干式恒温器、漩涡振荡器等之前很少接触到的仪器，也培养了团队协作的能力，更明白了科学研究更重要的是实践和领悟，不能只做试验而不思考，也不么能每天只看文献而不动手去做，应该思考过后再动手去验证自己的想法，这样才能有最大的收获。
实验讲义溶菌酶的提取和活性测定南方医科大学药学院I 溶菌酶的提取和部分纯化【试验目的】掌握根据等电点的差异，用离子交换层析方法进行分离纯化蛋白质。
【试验原理】溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶，相对分子量为1.44×104，可以催化水解细菌细胞壁N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖的ß－1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成份分解成可溶性的糖肽，细菌细胞内容物溢出，使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于动植物中，比如鸡蛋、人的泪液、乳汁等等，其中以鸡蛋清中的含量最高。
下表是鸡蛋清中各种蛋白质的种类、含量和某些特性。
从表中可以看出，蛋清中大部分蛋白质的等电点在6.05以下，只有溶菌酶和卵白素的等电点在10以上，而溶菌酶的含量是卵白素的70倍。
在pH值7.0的缓冲液中，只有溶菌酶和卵白素带正电荷，其他蛋白质带负电荷，因此，可以通过阳离子交换层析，把溶菌酶和其他蛋白质分离，使溶菌酶得到部分纯化。
【仪器、材料和试剂】(一)、仪器分光光度计（二）、材料1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）3、新鲜鸡蛋4、Amberlite阳离子交换树脂5、氯化钠（三）试剂1、PBS缓冲液：0.10M的磷酸盐缓冲液，pH7.0。
2、杂蛋白洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.05M。
3、溶菌酶洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.5M。
【实验步骤】（一）树脂的再生Amberlite阳离子交换树脂用0.5mol/L NaOH 浸泡30min，水洗至中性；再用0.5mol/L HCl 浸泡30min，水洗至中性。
在PBS缓冲液平衡12小时以上。
（二）蛋清样品的准备市售新鲜鸡蛋3个，破蛋壳取出蛋清，除去黏稠状物体，加入2倍体积的PBS 缓冲液（pH7.0），搅拌均匀。
八层纱布过滤，取30ml澄清液体，其中取0.5mL 置于EP管中，于-20°C冻存备用，标记为样品1。
生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定名称实验目的和要求：实验材料：主要仪器：主要步骤：教师签名：时间：实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
一、实验目的1. 学习和掌握溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 了解溶菌酶的生物学特性及其应用。
3. 培养实验操作技能，提高实验设计能力。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体中的酶，主要作用于细菌细胞壁的肽聚糖，将其分解，导致细菌细胞壁破裂，从而杀死细菌。
溶菌酶在医药、食品、生物工程等领域具有广泛的应用。
本实验采用鸡卵清为原料，通过提取、分离纯化等方法获得高纯度的溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡卵清、NaCl、醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、硫酸铜、氢氧化钠、硫酸锌、硫酸镁、EDTA、SDS、考马斯亮蓝、磷酸缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统、磁力搅拌器、超声波破碎仪、低温冰箱、恒温培养箱、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 溶菌酶粗提取（1）取一定量的鸡卵清，加入适量的磷酸缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀。
（2）将混合液置于磁力搅拌器上，搅拌30分钟，使溶菌酶充分释放。
（3）将混合液在低温下（4℃）离心10分钟，取上清液作为粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）将粗提液用硫酸铵进行盐析，使溶菌酶沉淀。
（2）将沉淀用磷酸缓冲液（pH 6.0）溶解，再次离心去除杂质。
（3）将上清液用硫酸铜、氢氧化钠、硫酸锌、硫酸镁、EDTA等试剂进行亲和层析，进一步纯化溶菌酶。
（4）收集纯化后的溶菌酶，用SDS-PAGE进行电泳分析，鉴定溶菌酶的纯度。
3. 溶菌酶活性测定（1）取一定量的溶菌酶溶液，加入等体积的底物溶液，混匀。
（2）在特定波长下，测定溶菌酶催化反应产生的吸光度变化。
（3）根据吸光度变化计算溶菌酶的活力。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）将纯化后的溶菌酶进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质条带。
（2）通过凝胶成像系统对电泳图谱进行分析，鉴定溶菌酶的纯度。
（3）根据蛋白质分子量标准曲线，计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取实验过程中，鸡卵清中的溶菌酶被充分释放，粗提液呈现出淡黄色。
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，具有分解细菌细胞壁的能力。
本实验通过提取鸡蛋中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 氯化钠- 醋酸铵- 酒精- 乙醚- 磷酸盐缓冲液- 离心机- 电泳仪- 超声波清洗器- 蛋白质定量仪- 分光光度计2. 实验试剂：- 氯化钠溶液- 醋酸铵溶液- 酒精溶液- 乙醚溶液- 磷酸盐缓冲液- 蛋白酶抑制剂四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄和蛋白，混合均匀。
- 将混合液用氯化钠溶液调至pH 7.0，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将滤液用醋酸铵溶液调至pH 4.5，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
- 将滤液加入等体积的酒精溶液，室温下静置过夜。
- 用纱布过滤混合液，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤三次，收集洗涤液。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 将洗涤液用超声波清洗器处理30秒，使溶菌酶充分溶解。
- 用分光光度计测定洗涤液的蛋白浓度。
- 将洗涤液稀释适当倍数，进行酶活力测定。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 将洗涤液进行SDS-PAGE电泳，比较样品与标准蛋白的迁移率。
- 根据迁移率计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 滤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从鸡蛋中提取出来。
2. 溶菌酶的分离纯化- 酒精沉淀法可以有效地将溶菌酶与其他蛋白分离。
- 洗涤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从沉淀中分离出来。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 洗涤液的蛋白浓度为1.5mg/mL。
- 酶活力为100 U/mL。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 电泳结果显示，样品与标准蛋白的迁移率一致，说明溶菌酶已达到纯化。
