流式细胞术免疫分型基础

流式细胞术（FCM）的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。

它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。

随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非常重要的作用。

本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学等方面的应用进行了综述，展示了FCM 在免疫学上应用的广阔前景。

关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞或微粒定量分析和分选的新技术。

其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析。

流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学科尤其是在免疫学方面得到广泛应用[1]。

近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展。

流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。

随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径[2]。

1 .流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光/或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感兴趣的细胞进行分选[3]。

四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识（完整版）白血病免疫分型是利用不同单克隆抗体检测白血病细胞胞膜和胞质抗原，通过流式细胞术(FCM）分析其表型，实现对白血病细胞系列来源及其分化程度的诊断。

白血病免疫分型已成为诊断白血病的必要依据，同时也可为微小残留病（MRD)的检测以及白血病的治疗和预后提供重要信息。

白血病免疫分型是细胞形态学分型的重要补充和进一步深化，以荧光标记技术联合FCM检测并判定白血病免疫表型，具有准确、快速、客观、重复性好、特异性强等特点，提高了白血病诊断的准确性[1, 2]。

采用不同数量及组合的荧光标记免疫抗体处理白血病细胞并进行荧光检测及分型是免疫分型的关键环节。

准确诊断需要选择一定数量的抗体，白血病免疫分型涉及多个造血系列的抗原，但目前国内甚至国际上均无规范化的方案可以借鉴；国内不同的医疗单位所用的抗体数量和种类均有较大的异质性，有些单位由于应用的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的判断。

鉴于国内的实际情况，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组经过多次讨论，提出以CD45/侧向散射光（SSC）为基础的中国FCM急性白血病免疫分型四色方案，本方案以2组表面抗原作为筛查抗原，试图利用相对少的抗体，达到对各个类型白血病进行较全面的检测，具有快速、客观、准确的特点。

已在国内的多家医疗单位试用，证明此方案能够满足临床的需要[3, 4]。

目前，虽然国际上有八色甚至十色方案[5, 6, 7]，但对仪器及操作人员的技术要求较高。

鉴于国内的实际情况，我们首先提出中国FCM急性白血病免疫分型四色方案，供从事急性白血病免疫分型的实验室参考，以期促进我国急性白血病免疫分型诊断的规范化及整体水平的提高。

一、四色方案的基本要求理想的急性白血病免疫分型方案应满足以下几点要求：①识别白血病细胞，能将其与正常细胞或反应性细胞相区别；②鉴别白血病细胞的系列来源；③根据细胞的分化程度对疾病进行亚型分型；④鉴别用于检测MRD 的白血病相关免疫表型(LAIP) ;⑤帮助判断某些特异分子改变，即基因型检测；⑥提供预后相关及治疗靶点的免疫标志检测结果。

流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种利用流式细胞仪对细胞或其他生物颗粒进行快速、多参数、定量分析和分选的技术。

在免疫学领域，流式细胞术具有广泛的应用，为免疫学家提供了一种强大的研究工具。

1. 免疫细胞分型和计数：流式细胞术可以通过标记抗体与细胞表面或内部的特定抗原结合，从而对不同类型的免疫细胞进行分类和计数。

这对于监测免疫系统的状态、研究免疫疾病以及评估免疫治疗效果非常重要。

2. 细胞活化和功能分析：流式细胞术可以检测细胞表面标志物的表达水平，从而评估免疫细胞的活化状态和功能。

例如，通过检测 CD69、CD25 等活化标志物的表达，可以研究T 细胞的活化；通过检测细胞因子的表达，可以分析 Th1、Th2、Th17 等不同类型的 T 细胞亚群。

3. 免疫细胞凋亡检测：流式细胞术可以通过 Annexin V/PI 双染色法等技术，检测免疫细胞的凋亡情况。

这对于研究免疫细胞的生存和死亡调节机制、评估药物对免疫细胞的影响以及探讨免疫相关疾病的发病机制具有重要意义。

4. 免疫细胞分选：流式细胞仪可以根据细胞的物理或生物学特性，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。

这一技术在细胞培养、基因转染、单细胞分析等方面具有重要应用。

5. 高通量筛选：流式细胞术可以同时分析大量样本，实现高通量筛选。

这对于药物筛选、抗体发现以及寻找新的免疫治疗靶点等研究具有重要价值。

总之，流式细胞术在免疫学中的应用非常广泛，为深入了解免疫系统的结构和功能、探索免疫相关疾病的发病机制以及开发新型免疫治疗策略提供了重要的技术支持。

流式细胞术的基本原理及其应用流式细胞术的基本原理是通过将携带荧光标记物的细胞单个穿过一个经过纳米级微孔的流动细胞仪中，在仪器静止状态下，用激光束照射细胞，测量细胞散射光强度和荧光素（荧光标记物）发射光强度，并对荧光标记物进行定量和定性分析。

流式细胞术有多个功能模块来实现这些原理，包括样本处理和采集、检测光源、光学系统、示波器、计算机控制和数据分析软件等。

应用方面，流式细胞术在免疫学、细胞生物学和药物研发等领域具有广泛的应用。

以下是几个流式细胞术的应用举例：1.免疫细胞表型分析：可以通过流式细胞术对白细胞表面的特定抗体标记物进行检测和分析，了解免疫细胞的分布、组成和功能状态。

这种技术在临床用于诊断和监测疾病，例如血液肿瘤的分型和监测、感染和免疫疾病的诊断。

2.DNA细胞周期分析：流式细胞术可以通过染色体分析来检测细胞周期的不同阶段，并评估细胞的增殖和DNA损伤。

通过分析细胞周期，可以确定干细胞、肿瘤细胞和其他细胞类型的比例，从而研究生物学和疾病发展过程中的细胞生长和增殖。

3.细胞凋亡分析：流式细胞术可以用荧光标记物来检测和分析细胞凋亡（程序性细胞死亡）的过程。

凋亡是正常生理和病理过程中的重要事件，例如生长发育和肿瘤发生。

通过分析细胞表面和内部标记物的表达和活性变化，可以了解细胞凋亡的诱导和调控机制。

4.细胞分选和分离:流式细胞术可以通过荧光标记物和细胞大小、复杂性等参数来识别和分选特定类型的细胞。

这种细胞分选技术在基因表达、单细胞转录组学、干细胞研究等领域具有重要应用，可以帮助研究者对细胞进行单个细胞水平的分析。

5.离子指示染料测定：通过使用与细胞膜融合的离子指示染料，流式细胞术可以测定细胞内离子浓度和动态变化。

例如，钙离子（Ca2+）作为重要的细胞信号分子，流式细胞术可以实时监测细胞内钙浓度的变化，并研究其与细胞功能和相应生理过程的关联。

总之，流式细胞术作为一种高通量、高灵敏度和多参数的细胞分析技术，在免疫学、细胞生物学和疾病研究中起着至关重要的作用，不仅可以提供定量的细胞信息，还可以为深入理解细胞生命活动和机制提供有效的实验手段。

中国流式细胞术急性白血病免疫分型四色方案由于多参数流式细胞术(MFC)免疫分型具有客观、敏感、准确等特点，免疫表型已成为诊断急性白血病的重要依据之一。

因准确的诊断需要选择一定数量的抗体，涉及多个造血系列的抗原。

但目前国内甚至国际上没有规范化的方案可以借鉴。

而国内不同的医疗单位所用的抗体数量和种类均有较大的异质性，有些单位由于应用的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的判断。

鉴于国内的实际情况，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组经过多次的讨论，提出以CD45/SSC为基础的中国流式细胞术急性白血病免疫分型四色方案，供参考。

本方案不包括标本的采集、保存、制备、试剂和仪器的调整及急性白血病的诊断标准，这些对免疫分型同样重要，可参考相应的指南。

1．适应范围：1.1急性淋巴细胞白血病(ALL):z B系：早B前体-ALL(Pro-B), 普通-B-ALL(Common-B),前体B-ALL(Pre-B),及与Burkitt淋巴瘤进行鉴别z T系：早T前体-ALL (Pro-T), 前体T-ALL(Pre-T),皮质-T-ALL和髓质-T-ALL.1.2急性早幼粒细胞白血病（APL）1.3急性髓细胞白血病（AML）z AML微分化型（AML-M0）z AML伴粒系和单核细胞分化型（AML-M1/2和AML-M4/5）z急性红白血病（AML-M6）z急性巨核细胞白血病（AML-M7）1.4前体树突细胞肿瘤1.5急性嗜碱性粒细胞和肥大细胞白血病1.6 混合表型白血病1.7 对上诉急性白血病治疗后检测MRD的标志进行筛查2.抗体的选择：根据检测的目的，需要检测不同的抗体：2.1 鉴别急性、慢性白血病:对于急性髓细胞白血病，可以根据CD45/SSC图型进行初步判断。

髓系白血病细胞CD45的表达较弱，往往位于正常淋巴细胞下方，且多数白血病细胞SSC较低（除去大颗粒APL患者）。

再根据CD34、CD117、CD38、HLA-DR、CD123的表达进行判断。

免疫细胞分型鉴定
免疫细胞分型鉴定是指对免疫系统中的不同细胞类型进行鉴定和分类。

免疫细胞是组成免疫系统的关键组成部分，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞等。

以下是一些常见的免疫细胞分型鉴定方法和指标：
1.免疫表型分析：利用流式细胞术（flow cytometry）等技术，
通过检测细胞表面的免疫标记物（抗原）来确定细胞的类
型。

例如，CD3、CD4和CD8用于T细胞的鉴定，CD19用
于B细胞的鉴定，CD56用于NK细胞的鉴定等。

2.细胞功能分析：通过测量细胞的功能，如细胞因子产生、
细胞毒性等，来鉴定细胞类型。

例如，T细胞可以通过检
测干扰素γ（IFN-γ）或白细胞介素-2（IL-2）产生来鉴定
Th1细胞；B细胞可以通过测量抗体产生来鉴定。

3.基因和蛋白质分析：使用分子生物学技术，如PCR和免疫
组化等，检测特定基因和蛋白质的表达来确定细胞类型。

例如，通过检测T细胞特异性基因编码的T细胞受体
（TCR）来鉴定T细胞子群。

4.细胞形态学分析：通过显微镜观察和分析细胞的形态和特
征来鉴定细胞类型。

例如，T细胞通常具有细的胞质、圆
形或椭圆形的细胞形态。

通过免疫细胞分型鉴定，可以对不同种类的免疫细胞进行准确的鉴定和分类，从而更好地了解免疫系统的功能和调节机制。

这对于研究免疫相关疾病的发病机制、制定免疫治疗策略以及评估免疫疫苗效果等有重要意义。

白血病流式免疫分型白血病是一种造血系统恶性肿瘤，由于白细胞数量和质量的异常增加，导致机体免疫功能下降，造成多种系统和器官功能异常。

白血病的治疗首先需要确定其类型和分型，以便制定有效的治疗方案。

流式免疫分型作为一种先进的白血病诊断技术，已被广泛应用于临床实践中。

白血病流式免疫分型是将细胞标记物与荧光标记结合，通过流式细胞术对细胞进行定量、定性的分析，进而确定白血病的类型、分型。

它可以快速、灵敏地检测单个细胞，检测出极低浓度的异常白细胞，并对相关疾病进行准确的诊断和分类，特别是对淋巴瘤和白血病的鉴别诊断。

流式免疫分型在白血病治疗诊断中的应用既可以确定疾病的类型，也可以指导治疗方案的制定。

对于急性白血病的治疗而言，流式免疫分型可以评估化疗药物敏感性、预测预后，以及指导骨髓移植的实施，从而提高治疗的效果和疗效。

对化疗失败的慢性淋巴细胞白血病患者进行流式免疫分型，可以确定其恶性程度、预测预后及制定诊断治疗方案，如靶向药物治疗等新的治疗手段。

不过，需要指出的是，流式免疫分型虽然是一种有效的白血病诊断技术，但其存在一定的局限性。

例如，对于某些罕见的白血病类型，目前流式免疫分型无法完成准确的分类，需要结合其他诊断手段进行综合判断。

同时，由于流式免疫分型涉及大量的细胞学和生化实验，其实验成本也比较高，还需要一定的技术开销和专业操作的知识。

综上所述，白血病流式免疫分型作为一种先进的白血病诊断技术，已经逐步成为临床实践中的标准操作。

它可以对白血病患者进行准确的分类和疾病诊断，指导治疗方案的制定，同时也为临床科研提供了有力的手段和工具。

但需要注意的是，流式免疫分型还需要不断探索和深入，结合其他先进技术和诊疗方法，共同提高白血病治疗的水平和效果。

近年来白血病得免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少得重要标准之一、早年曾用过得荧光显微镜或APAAＰ方法基本被废弃。

国际上公认得通用得方法就是流式细胞术(FCM)。

流式细胞术白血病免疫分型就是利用荧光素标记得单克隆抗体(McAb)作分子探针,多参数分析白血病细胞得细胞膜与细胞浆或细胞核得免疫表型,由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。

ﻫ1、流式细胞仪诊断白血病得依据⑴FＣM能快速,多参数,客观得定性又定量测定细胞膜、浆、核得抗原表达ﻫ⑵至今尚未发现白血病得特异抗原。

ﻫ⑶能用正常血细胞得单抗来进行免疫分型就是基于白血病形成得分化阻断学说。

即白血病细胞基因异常,分化受阻于某阶段形成不同亚型得白血病、这群细胞充盈于骨髓。

正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞得过程中,细胞膜、细胞浆或胞核抗原得出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞得分化发育阶段密切相关,而且表现出与细胞系列及其分化程度相关得特异性。

因此,这些抗原得表达与否可作为鉴别与分类血细胞得基础。

白血病就是造血系统得恶性肿瘤,在形态上变化虽相当大,但仍能表达正常血细胞所具有得抗原,因而仍可依据其抗原得表达谱对白血病进行免疫分型。

2、流式细胞仪诊断白血病得意义ﻫ⑴骨髓血细胞就是形态学分型得基础,FCＭ白血病免疫分型就是对形态学分型得重要补充与进一步深化,国际白血病MIＣ分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都就是必不可少得,对下列情况意义更大:①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源得白血病。

②形态学为急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性未分化白血病(AUL)但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。

③混合性白血病。

④部分髓系白血病。

目前,免疫分型对粒细胞与单核细胞白血病得鉴别尚有一定困难。

⑤慢性淋巴细胞白血病。

⑥微小残留白血病、⑵临床预测;可根据抗原得表达情况预测病情得预后:如白血病患者有ＣD7+与CＤ3４+共表达,预后不好。

⑶疾病监测:可监测病程得发展,疗效,可进行微小残留白血病得检测。

免疫分型标准免疫分型是指根据免疫系统的特定指标对个体的免疫状态进行分类和评估。

免疫分型标准通常基于免疫细胞的数量、功能、表面标志物等因素，以及体液免疫指标，如抗体水平。

这有助于更好地了解个体的免疫功能，为疾病预防、诊断和治疗提供有针对性的信息。

免疫分型的主要标准包括以下几个方面：免疫细胞数量和比例：淋巴细胞计数：包括T细胞、B细胞、NK细胞等。

通过流式细胞术等技术检测。

CD4+/CD8+T细胞比例：正常范围通常在1.0-2.5之间。

该比例可反映T细胞的免疫调节状态。

免疫细胞功能：淋巴细胞功能检测：如T细胞的增殖能力、B细胞的抗体产生功能等。

这些功能可以通过体外实验室技术进行评估。

免疫球蛋白水平：IgG、IgA、IgM水平：通过血清学检测，评估体液免疫的状况。

特定抗体水平：如疫苗接种后特定病原体的抗体水平，反映对该病原体的免疫记忆。

炎症标志物：C反应蛋白（CRP）、血沉等：反映机体炎症状态，对于炎症性疾病的评估有一定意义。

HLA分型：人类白细胞抗原（HLA）分型：通过检测HLA基因，了解个体对抗原的免疫反应差异，对器官移植、免疫相关疾病的研究有重要意义。

免疫功能评估：免疫球蛋白亚型：了解IgG的亚型分布，对免疫功能的细致评估提供信息。

细胞因子水平：如干扰素、白介素等，反映机体对病原体的免疫应答状态。

过敏和自身免疫标志物：IgE水平：过敏体质的评估。

自身抗体检测：检测自身抗体水平，帮助诊断自身免疫疾病。

免疫分型的意义：免疫分型有助于了解个体的免疫状况，为疾病的早期预防、诊断和治疗提供科学依据。

在移植手术前，免疫分型也对移植的配型和免疫抑制治疗方案的制定具有指导作用。

免疫分型的发展不仅在免疫学研究领域有着广泛应用，同时也推动了个体化医疗的发展。