细胞培养所用玻璃及塑料 制品的清洗与消毒

放射灭菌
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紫外光射线 适用范围：控制空气污染，消毒物品表面 。 限制：对皮肤及眼有害，穿透力小，不能透 过玻璃。 电离辐射 适用范围：消毒对热敏感的外科器械等 。 限制：昂贵、需特殊装置。
0.22 ~0.45 µ m
过滤
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膜滤器
适用范围：对热敏感的液体，如血清和动物培养基。 限制：需先清除悬浮物质，一些有用的活性物质可能被 吸附掉。
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单独使用时，一般只用于空气和台面的消毒。如仅用 紫外线照射带菌的器皿，则无法彻底灭菌，所以应与 其他消毒方法结合使用，如先用75％的酒精浸泡，再 照紫外线消毒灭菌等。 ②检查消毒灭菌效果照射后为检查超净台是否达到无 菌效果，可在已照射的洁净台四角和酒精灯旁分别放 置5个含琼脂糖半固体培养基的直径90 mm培养皿， 20 min后再转入37℃培养箱中培养72 h，观察细菌生 长情况。如果每块平皿上无菌落生长，说明洁净台符 合无菌标准。
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玻璃器皿的灭菌包装 � 1 局部包装：较大器皿如培养瓶，烧杯，容量 瓶，三角瓶等以及体积较小瓶口包装方便的容 器如青霉素瓶等，采用局部包装。
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2 全包装：体积较小的培养皿、注射器、胶塞、 尽速器械（剪刀、镊子）等采用全包装。 1 直接装入率饭盒，再用细胞培养灭菌袋灭菌。 缺点：密封不严，不宜长时间使用。 2 纸包装， 要掌握正确包装方法，不要是锐器 扎破包装纸。
常用灭菌方法
物理灭菌法
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湿热灭菌:高温高压法、流动蒸汽或沸水 干热灭菌：烤箱、焚烧、酒精灯 射线照射灭菌：紫外线、电离辐射 过滤灭菌：微孔滤膜、玻璃丝滤器 超声射线消毒灭菌 主要使用6OCo、X射线进行消毒灭菌，可用于 牛血清和塑料制品的灭菌。 (2)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热 灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒 方法之一。 ①消毒方法 现在一般用无臭氧型紫外灯。消毒的效能与距离成反 比，：进行空气消毒时灯管应距地面2.5 m以内；台面的消毒应在 80 cm以内；培养器皿的消毒在30 cm以内。 消毒的时间与效能存 在一定关系，但不是绝对的：照射20 min后，有71％的细菌被消 灭；40 min后79％的细菌被消灭；60 min后86％的细菌被消灭。 紫外线照射时间再长也不是100％的灭菌，最多只能把90％的细菌 消灭，过长的照射是没有意义的。

花鲈肌肉和肝脏组织细胞原代培养1.细胞培养准备工作准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。

具体工作如下：一、清洗（1）常用器具：细胞培养瓶、细胞培养板、培养皿、广口瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、电子天平、纱布、脱脂棉、止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀、解剖针、注射器、注射器过滤器、移液枪、枪头、离心管、细胞冻存管、酒精灯、试管架、超净工作台、倒置显微镜、生化培养箱、烘箱、液氮罐、封口膜、喷壶、以及洗刷用品等。

（2）玻璃器皿清洗：烧杯、量筒、玻璃棒、广口瓶（瓶盖不泡盐酸，清洗赶紧后直接高压灭菌）等玻璃器皿自来水刷洗，除去灰尘，烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净，然后用蒸馏水冲洗干净后用烤箱烘干，高压灭菌，烘干备用。

（3）塑料器皿的清洗：细胞培养皿、培养板、培养瓶可以直接使用，进口枪头、进口离心管高压灭菌。

（4）金属制品的清洗：止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀等先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。

放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。

（5）棉织品：纱布和脱脂棉，高压灭菌，再烘干备用。

二、溶液配制（1）PBS：用电子天平准确称取NaCl /8.0 g，KCl /0.2 g，KH2P04/0.29 g，Na2HP04-12H20/ 1.42 g溶于800 mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至溶解后调节pH值为7.2～7.4，然后定容至1L。

置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4℃冰箱冷藏备用。

等渗0.01MPBS（1X PBS）细胞培养用，用电子天平准NaCl/8.00g浓度为8/58.5=0.13675M，本配方主要靠NaCl，KCl/0.20g浓度为0.2/74.5=0.00268M，Na2HPO4·12H2O/2.90g浓度为 2.90/358= 0.0081M Na2HPO4·2H2O/1.44g浓度为 2.90/358=0.0081M，KH2PO4/0.24g浓度为0.25/136= 0.0019M，溶于800 mL的dddH2O，用玻璃棒搅拌至溶解，dddH2O定容至1000ml。

一、新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。

5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。

6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。

7.高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消：1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。

2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。

3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。

4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。

（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。

金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。

放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。

橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。

细胞培养用的玻璃器皿清洗过程步骤：按浸泡→刷洗→浸酸→冲洗等四步程序进行。

①浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%~5%盐酸浸泡过夜或煮沸 30min，水洗。

要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。

用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。

②刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。

要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。

禁止用去污粉。

因其中含有砂粒。

会严重破坏玻璃器皿的光洁度。

特别注意刷洗瓶角部位。

酸浸之前要把洗涤剂冲干净。

③浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。

清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。

经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全清除。

④冲洗：先用自来水充分冲洗，吸管等冲流10min，瓶皿需每瓶灌满、倒掉，反复10次以上。

然后再经蒸馏水漂洗3次,不留死角。

晾干或烘干备用。

对已用过的器皿，凡污染者必先经煮沸30min或放3%盐酸中浸泡过夜，未污染者可不需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。

【附】清洁液的配制和使用注意事项1.清洁液(配方见表2-1)①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。

②先将重铬酸钾溶于水（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。

③缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险(绝不可将重错酸饵液倒入浓硫酸中)。

④清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。

由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好防护。

2．矽酸钠洗液贮存液(×100)砂酸纳80克加偏磷酸钠9克加热溶在1000ml水中。

使用时用水稀释100倍，将器皿放入煮沸20min，冷却后冲洗，再用2%HCl浸泡2h 后，自来水冲洗。