污水处理工艺对氨氧化菌及细菌群落的影响1

中国环境科学2009,29(6)：622~628 China Environmental Science 污水处理工艺对氨氧化菌及细菌群落的影响王晓慧,文湘华*,杨宁宁,许美兰,丁鵾(清华大学环境科学与工程系,北京100084)摘要：采用针对氨氧化菌(AOB)功能基因氨单加氧酶(amoA)的末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)、克隆测序等方法,研究了北京市2 个污水处理厂的 4 个污水处理系统中 AOB 的群落结构,同时采用针对 16S rRNA 基因的 T-RFLP 技术分析了总细菌的群落结构.T-RFLP指纹图谱分析表明,4个污水处理系统中AOB的优势限制性片段(T-RF)均为291bp和354bp,细菌的优势T-RF为115,117,166,455,465, 468,471,482,800,893bp 等.说明污水处理工艺对系统中 AOB 及细菌的群落结构影响很小.对功能基因 amoA 的系统发育分析表明,4 个污水处理系统中优势AOB均属于Nitrosomonas europaea cluster和Nitrosomonas oligotropha culster.关键词：氨氧化菌(AOB)；末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)；氨单加氧酶(amoA)；处理工艺中图分类号：X171.5文献标识码：A文章编号：1000-6923(2009)06-0622-07Impacts of wastewater treatment process on AOB and bacteria communities. WANG Xiao-hui, WEN Xiang-hua*, YANG Ning-ning, XU Mei-lan, DING Kun (Department of Environmental Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China). China Environmental Science, 2009,29(6)：622~628Abstract：Communities of AOB in activated sludges collected from 4 wastewater treatment systems in 2 plants in Beijing were examined using specific PCR followed by terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), cloning, and sequencing of amoA genes. Communities of bacteria were also investigated by using T-RFLP based 16S rRNA genes. The T-RFLP fingerprints analysis showed that the dominant terminal restriction fragments (T-RFs) of AOB were 291, 354 bp, and the dominant T-RFs of bacteria were 115, 117, 166, 455, 465, 468, 471, 482, 800 and 893 bp etc. in all these 4 systems. The T-RFLP profiles analysis may also indicate the AOB and bacteria structures were slightly affected by the treatment process. Phylogenetic analysis of cloned amoA genes clearly showed that the dominant AOB in these 4 systems were members of Nitrosomonas europaea cluster and Nitrosomonas oligotropha cluster.Key words：ammonia-oxidizing bacteria (AOB)；T-RFLP；amoA；treatment process城市污水处理厂普遍存在脱氮过程不稳工艺对微生物群落结构影响的研究还很少.定的现象[1-2].导致问题出现的重要原因之一是本研究采用T-RFLP解析了北京某城市污水硝化细菌,特别是氨氧化菌(AOB)生长缓慢,对处理系统中AOB及细菌的群落结构,并分析了处水质和运行参数等的冲击敏感.因此,氨氧化过理工艺对微生物群落结构的影响,旨在为污水处程被认为是硝化反应的限速步骤[3].深入理解理系统的稳定运行与优化控制提供科学依据.污水处理工艺中AOB的群落结构和功能,对控1材料与方法制和提高污水处理过程中脱氮的稳定运行具有重要作用[4-5].1.1污水处理系统及采样传统的微生物培养方法很难获得微生物群活性污泥样品采集于北京市2个污水处理落结构的准确信息[6].由于末端限制性片段长厂的4个污水处理系统中,系统A1、A2和系度统多态性技术(T-RFLP)具有相对高的灵敏度和可B1、B2 分别位于厂A 和厂B 中.这 4 个污水处重复性[7],已经被广泛用来解析环境中微生物的理系统的工艺不同,A2和B1为A2O工艺,A1为群落结构[8-13].已有研究者分析了不同污水处理收稿日期：2008-11-28系统中运行条件和环境参数,如水质[14]、DO[10],基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAC19B01-02) SRT[3]等对微生物群落结构的影响.但针对处理* 责任作者, 教授, xhwen@6 期王晓慧等：污水处理工艺对氨氧化菌及细菌群落的影响623倒置A2O工艺,B2为AO工艺.系统A1和A2处进行T-RFLP分析时,AOB正向引物amoA-1F理对象为生活污水,系统B1和B2处理对象均为的5′端用FAM荧光素标记,PCR反应后即可得到生活污水和工业废水的混合废水.4个污水处理荧光标记的DNA片段.扩增产物用QIAquick系统的部分进出水水质及运行参数见表 1. PCR Purification Kit试剂盒(Qiagen公司,德国)进行纯化.表1污水处理系统运行参数Table 1 Parameters of wastewater treatment systems项目A1A2B1B2进水BOD(mg/L)236236156141.2进水NH4+-N(mg/L)41.041.045.943.6进水TN(mg/L)58.658.652.560.4出水BOD(mg/L)11.29.22 6.67.7出水NH4+-N (mg/L) 2.14 1.150.4 4.1出水NO2--N(mg/L) 3.73 1.220.20.96出水NO3--N(mg/L)9.5212.3723.47.75出水TN(mg/L)17.617.125.216.1污泥浓度(mg/L)34323209SRT(d)1313DO(mg/L) 2.29 2.58所有活性污泥样品均采集于2007年8月,具体的采样位置为每个系统好氧区的末端,每个用引和1反应(Tris 15mm (2.5m 1μL,本),3预变45s,共1.4酶切反应样品 1.5mL,样品采集后立即置于冰上,运至实验6h.反应体系均为20μL,包括PCR 产物10μL,限制室.离心(14000×g)弃上清液后,-20℃保存.性内切酶1μL,缓冲液2μL,牛血清白蛋白1.2 DNA提取(200μg/mL)2μL,灭菌高纯水为5μL.酶切之后进采用FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒行脱盐纯化[15],荧光标记的片段再用ABI 3130(Qbiogene 公司,美国)提取活性污泥中的总DNA.型遗传分析仪(Applied Biosystems,美国)进行分活性污泥样品首先用灭菌高纯水离心(14000×g)清离,内标为500LIZ.取荧光强度50 RFU为基线,洗2遍后,再按照试剂盒产品说明书提取总DNA.得到的T-RFLP图谱用GeneMap(Version 3.7)进1.3 PCR扩增行分析.对于小于50bp的片段,舍去不进行后续对于AOB的扩增,选用针对功能基因amoA 的分析.在每个T-RFLP图谱中,计算每个峰的峰面引物对amoA-1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTG 积与所有峰总面积的比率来表征每个末端限制GT-3′) 和amoA-2R(5′CCCCTCKGSAAAGCCTT 性片段(T-RF)的相对量.对于AOB,舍去相对数CTTC-3′;K 表示 G 或 T;S 表示 C 或 G).PCR 反应量小于2%的T-RF,而对于细菌,舍去相对数量小体系为50μL,包括1μL模板DNA,5μL缓冲液于1%的T-RF. (Tris-HCl 100mmol/L, KCl 500mmol/L,MgCl2 1.5 多样性指数15mmol/L), 4μL 脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混多样性指数选取Shannon-Weiner指数(H),合物(2.5mmol/L),正反向引物(10pmol/μL)各其计算公式为:H= −∑Pi ln P i,其中P i表示每个2μL、0.25μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL,TaKaRa,日本),35.75μL灭菌高纯水.PCR扩增程序如峰面积占总面积的比率.下:94℃预变性5min;94℃变性60s,55℃退火 1.6 克隆文库建立和测序90s,72℃延伸90s,共40 个循环;72℃延伸10 min.用非荧光标记的引物对AOB进行PCR扩增,624 中 国 环 境 科 学 29 卷扩增产物连接到 pGEM -T Easy 载体(Promega,美国)上,再转化到 Escherichia coli DH5α TM 细胞中.通过蓝白斑筛选阳性克隆,并用 T7 和 SP6 作为引物的 PCR 反应检验克隆是否插入正确长 度的片断.以插入正确片段的阳性克隆为模板,再 用 AOB 的引物进行 PCR 反应,对 PCR 反应产物 进行酶切电泳分析和 T -RFLP 分析,结合两者的 结果对 AOB 克隆进行分类,挑取每个类型的克 隆菌液进行测序(北京诺赛基因公司).1.7 序列系统发育学分析获得的 amoA 基因序列与 GenBank 进行比 对 (), 并 下 载 相 近 序 列 . 用 Mega4.0 软件对序列选取最小相邻法(Neibor joining)构建系统发育树. 2 结2.10 1RF 非354b 349b491b 美国果表RF.P反应的 T荧光强度(R F U )100200300400500600700片段长度(bp)图1不同污水处理系统AOB的T-RFLP图谱Fig.1 T-RFLP profiles of AOB indifferent wastewater treatment systems由图2可见, 4个污水处理系统总细菌的19,18,19,18个,所有系统均含有的优势T-RFT-RFLP 图谱较为复杂,系统 A1,A2,B1 和 B2片段为115,117,166,455,465,468,471,482,800,的显著峰(相对量大于1%的T-RF)数量分别为893bp.另外不同系统也含有一些非共性的6 期 王晓慧等：污水处理工艺对氨氧化菌及细菌群落的影响 625T -RF, 如 系 统 A1 含 有 56,310,439,471,772, 有 119, 474, 492, 762, 783bp 等.4 个系统的 789bp 等,系统 A2 含有 95,423,439,474,745bp Shannon -Weiner 指数分别为 2.64,2.51,2.54, 等, B1 含有 119, 449, 745, 783bp 等,系统 B2 含 2.46.4000A 12000荧光强度(R F U )100200300400500600700800900片段长度(bp)图 2 不同污水处理系统细菌的 T -RFLP 图谱Fig .2T -RFLP profiles of bacteria in different wastewater treatment systems2.2 处理工艺对微生物群落结构的影响含有的优势 T -RF 也为 16 个,Shannon -Weiner 指系统A1 与A2 处理相同水质,规模相似,前者 数相差也很小.为 A 2/O 工艺,后者为倒置 A 2/O 工艺,两者这表明,本研究涉及的工艺对 AOB 的群落AOB的T-RFLP图谱相似,均含有大量219,354bp 的结构影响较小. Rowan等[16]研究发现曝气生物滤T-RF 和少量 439,491bp 的 T-RF.系统 A1 和 A2池中AOB的多样性比滴滤池中更高.Dytczak的细菌T-RFLP图谱也较为相似,Shannon-[17]等研究表明,缺氧/好氧交替运行的SBR反应Weiner 指数也相差很小.器与严格好氧SBR反应器中优势AOB差异很大,系统B1和B2处理相同水质,规模相似,前者前者优势AOB为Nitrosomonas,后者优势AOB为A2/O工艺,后者为A/O工艺,两者AOB 的为Nitrosospira.而本研究中不同工艺的处理系统T-RFLP 图谱较相似, 优势 T-RF 片段均为具有相似的AOB及细菌群落结构,这可能是219,354bp.但两者图谱也存在一些细微的差别,A2/O 工艺与倒置 A2/O,A2/O 与 AO 工艺的差别如系统B1含有少量491bp,而系统B2不含此片不是很大,微生物的生存环境相似,工艺之间的选段.系统B1和B2的细菌图谱较为相似,两者共同择不足以使系统选择不同的优势微生物.626 中 国 环 境 科 学 29 卷2.3 AOB 系统发育分析为了解析 AOB T -RFLP 指纹图谱中不同的 峰(T -RF)代表哪种或哪类微生物,对系统 A2 和 B1 的样品建立了 AOB 克隆文库,并对每个克隆 进行 T -RFLP 分析.每个克隆样品只含有一种 AOB 的 amoA 基因片段, 因此克隆样品的 T -RFLP 图谱为单峰,图 3 为部分典型克隆的 T -RFLP 图谱.选取不同类型的克隆进行测序,通过在 GenBank 中的 BLAST 比对分析,即可知道 每个类型的克隆及峰对应何种微生物.克隆测序 及系统发育分析表明(图 4),系统中的优势 AOB 均属于 Nitrosomonas ,该结果和以前的部分研究结果一致[3,10,16,18-22].通过克隆的 T -RFLP 分析可知,219 bp 属于 Nitrosomonas europaea cluster; 354 bp 属于 Nitrosomonas oligotropha culster;491 bp 属于 Nitrosomonas communis culster.纯培养研 究 表 明 , 增 长 速 度 较 快 的 Nitrosomonas , 如 N.europaea ,其 μmax 为 0.088h -1,而 Nitrosospira 的μmax 为 0.033~0.035h -1. 这种生长优势可能使Nitrosomonas 成为城市污水处理厂活性污泥系clusteNH 4+耐受的影统中优势 AOB 的原因之一[1].另外有报道[4]指出, 系统 A1、A2 和 B1 中存在少量的 491 bp 和其他生态系统相比, 在城市污水处理厂中 T -RF,该峰代表 N. communis cluster 的 AOB.有 Nitrosospira 并不重要. 研究者在土壤、活性污泥与生物膜系统中发现 4 个系统的 T -RFLP 图谱中均包含大量 了此类 AOB [4].与 N. oligotropha cluster 相比,该219bp 的 T -RF,该峰代表 N.europaea cluster 的 类AOB 对NH 4+-N 有较高的K s (0.20~0.60mg/L)[24], AOB.该类 AOB 广泛存在于城市污水处理厂的 适合在较高浓度的 NH 4+-N 环境中生存.有研究[1,3,4,10,20,23] +表明,N. communis 具有在DO 波动或低 DO 环境 活性污泥系统中 .此类AOB 对NH 4 -N有较高的半饱和常数(K s )(0.42~0.85mg/L),适合 中生存的优势.本研究中 4 个系统的运行工艺,在较高浓度的NH 4+-N 环境中生存.本研究中的4 均使微生物经历从厌氧到好氧变化的环境,这个污水处理系统, 进水 NH 4+-N 浓度均高于 可能是此类 AOB 出现在系统中的一个重要因40mg/L,系统中相对高的 NH 4+-N 浓度可能促使 素.但是也有研究表明[25],DO 只影响 AOB 的活该类 AOB 成为了系统中的优势 AOB.性,而不会影响 AOB 的群落结构.Lydmark 等 [23]4 个系统的 T -RFLP 图谱均含有大量 219bp认为现在还没有足够数据证明 DO 浓度和AOBT-RF,该峰代表N.oligotropha cluster 的AOB.文献类型之间存在关系.N. communis cluster的生理报道表明,此类AOB广泛存于在淡水,沉积物,土生化特性及其与环境因素之间的关系,还需要壤,和污水处理厂中[3,4,8,19].N. oligotropha的纯进一步研究.培养研究表明[23],其对NH4+-N的K s较低,在系统A1、A2和B2中也存在少量的439 bp 0.027~0.059mg/L 之间.但本研究中4 个系统的T-RF,但在克隆的 T-RFLP 分析中,未发现 T-RF进水NH4+-N浓度均较高,并不适合该类AOB 为439bp的图谱,这可能是挑选的克隆数量有限,生存.最近的研究结果表明,属于N.oligotropha没有发现T-RF为439bp的克隆.6 期王晓慧等：污水处理工艺对氨氧化菌及细菌群落的影响62781661009770B1Ni99Nitrosomonas sp. Nm47 (AY123830)40A791008163Nit10010080100A298GLII -20 (AFPaloAltoD07 (DQ682414)100100 78A2-9Nitrosomonas sp. Nm33 (AF272408)92A2-11Nitrosomonas communis (AF272399)10010072Nitrosomonas europaea Nm50 (AJ298710) 55Nitrosomonas sp. TK794 (AB031869) 99Nitrosomonas eutropha Nm57 (AJ298713) 100B199B1 1000.05图 4 AOB amoA 基因的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on comparison of amoA gene of AOB3 结论3.1 T -RFLP 图谱表明,4 个系统中 AOB 的优势 T-RF 均为 219 和 354 bp,细菌的优势 T -RF 为 115,117,166,455,465,468,471,482,800,893bp 等. 3.2 A 2/O 工艺与倒置 A 2/O 工艺的 AOB 和细菌 群落结构相似,A 2/O 工艺与 AO 工艺的群落结构 也相似.这是由于工艺间的差别不大,微生物的生 存条件相似,工艺之间的选择压不足以使系统选 择不同的优势 AOB. 3.3 系统进化分析表明,该研究中优势的 AOB为 Nitrosomonas oligotropha culster 和 N. europaea cluster,分别对应于图谱中219bp 及354bp 的T -RF.这 2相比,系统中参考文[1] Sim11[2] Qoxra20[3] Hbacteria in full-scale activated sludge628 中 国 环 境 科 学 29 卷processes with different solids retention time [J]. Journal of Applied Microbiology, 2005,99(3):629-640.[4] Limpiyakorn T, Shinohara Y , Kurisu F, et al. Communities of ammonia-oxidizing bacteria in activated sludge of various sewage treatment plants in Tokyo [J]. Fems Microbiology Ecology, 2005,54(2):205-217.[5] Lim J, Do H, Shin S G , et al. Primer and probe sets for group-specific quantification of the genera Nitrosomonas and Nitrosospira usingreal-time PCR [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2008,99(6):1374-1383.[6] Eschenhagen M, Schuppler M, Roske I. Molecular characterization of the microbial community structure in two activated sludge systems for the advanced treatment of domestic effluents [J]. Water Research, 2003,37(13):3224-3232.[7] Osborn A M, Moore E R B, Timmis K N. An evaluation of terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis for the study of microbial community structure and dynamics [J]. Environmental Microbiology, 2000,2(1):39-50.[8] Regan J M, Harrington G W, Noguera D R. Ammonia and nitrite-oxidizing bacterial communities in a pilot-scale chloraminated drinkingwater distribution system [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002,68(1):73-81.[9] Mintie A T, Heichen R S, Cromack K, et al. Ammonia-oxidizing bacteria along meadow-to-forest transects in the oregon cascade mountains [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(6):3129-3136.[10] Park H D,Noguera D R. Evaluating the effect of dissolved oxygen on ammonia-oxidizing bacterial communities in activated sludge [J]. Water Research, 2004,38(14/15):3275-3286.[11] Bernhard A E, Donn T, Giblin A E, et al. Loss of diversity of ammonia-oxidizing bacteria correlates with increasing salinity in an estuary system [J]. Environmental Microbiology, 2005,7(9): 1289-1297.[12] Yeager C M, Northup D E, Grow C C, et al. Changes in nitrogen-fixing and ammonia-oxidizing bacterial communities in soil of a mixedconifer forest after wildfire [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005,71(5):2713-2722.[13] Cabezas A, Draper P, Muxi L, et al. Post-treatment of a slaughterhouse wastewater: stability of the microbial community of a sequencing batch reactor operated under oxygen limited conditions [J]. Water Science and Technology, 2006,54(2): 215-221.[14] Sangchul R, An N H, Ahn D H, et al. PCR-T-RFLP analysis of bacterial communities in activated sludges in the aeration tanks of domestic andindustrial wastewater treatment plants [J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005,15(2):287-295.[15] Chan O C, Claus P, Casper P, et al. Vertical distribution ofstin2[16] Rdwid2[17] DonR[18] DNNc2[19] laofa3[20] Eare6[21] RascT[22] Pa[J[23] LeinM[24] Kpsp[25] PccT作者简系博士。