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可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
分子生物学研究方法
首先，核酸提取与分析是分子生物学的基础。
通过从生物体细胞中提
取核酸，可以获得DNA和RNA的样本，为后续的实验提供原料。
核酸的分
析方法包括凝胶电泳和聚合酶链式反应（PCR）等。
凝胶电泳可以根据核
酸分子的大小和电荷差异进行分离，从而获得目标核酸的纯度和浓度信息。
PCR是一种体外扩增DNA的方法，可以在短时间内从少量的DNA模板扩增
到大量的DNA产物，为后续实验提供更多的材料。
其次，蛋白质的表达与纯化是分子生物学的另一个重要研究方法。
蛋
白质是生物体内功能的执行者，因此研究蛋白质的表达与功能对于揭示生
命活动的机理具有重要意义。
蛋白质的表达通常利用重组DNA技术，将目
标基因克隆到可表达载体中，并转化到细菌或其他表达系统中。
随后，通
过诱导表达、细胞破碎、蛋白质纯化等步骤，最终获得目标蛋白质的产物。
蛋白质的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等多种方法，
可以根据蛋白质的性质和特点选择合适的方法进行纯化。
另外，生物信息学和计算生物学方法也是分子生物学研究的重要手段。
随着DNA测序技术的快速发展，大规模的基因组、转录组和蛋白质组数据
被不断积累，因此需要开发合适的计算方法进行存储、管理和分析这些数据。
生物信息学和计算生物学的研究方法涉及到生物数据库的建立和维护、序列比对、基因和蛋白质结构预测、分子动力学模拟等等。
这些方法可以
帮助研究人员更好地理解和分析分子生物学数据，从而揭示生命活动和疾
病发生发展的机理。
第六章
分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术
基因功能的研究思路主要包括:
1. 基因的亚细胞定位和时空表达谱;
2. 基因在转录水平的调控；
3. 细胞生化水平的功能研究：对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位；
4. gain-of-function & loss-of-function: 分别在细胞和个体水平，做该基因的超表达和敲除，从表型分析该基因的功能。
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究，综合分析。
本章内容
¾基因表达研究技术
¾基因敲除技术
¾蛋白质及RNA相互作用技术¾基因芯片及数据分析
¾利用酵母鉴定靶基因功能¾其他分子生物学技术
6.1 基因表达研究技术
6.1.1 基因表达系列分析技术6.1.2 RNA的选择性剪接技术6.1.3 原位杂交技术
6.1.4 基因定点突变技术
6.1.1 基因表达系列分析技术
基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）是1995年由Velculescu 等建立的技术，在整体水平上对细胞或者组织中的大量转录本同时进行定量分析，而无论其是否为已知基因。
9概念：
以DNA测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。
9原理：
根据理论上任何长度超过9～10(49=262144)个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列（转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性9～10个碱基的核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。
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9Long SAGE技术:
标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。
其原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（Mme I），并将程序做了相应修改。
6.1.2 RNA选择性剪切
9概念
指用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
外显子遗漏
相互排斥剪切
5’选择性剪切
3’选择性剪切
平衡剪切
图6-3 RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切
图6-4果蝇（Drosophila melanogaster）的Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多
种可能的mRNA异构体
6.1.3 原位杂交技术
9概念
用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。
9分类
RNA原位杂交技术
染色体原位杂交技术
RNA原位杂交技术
9原理：是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度和离子强度等）可按碱基互补原则退火（annealling）形成双链的过程。
这一杂交过程具有高度的特异性。
9待测的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞mRNA。
9用于检测的已知核酸片段称之为探针（probe）。
常用的标记物包括放射性标记和非放射性标记物两大类。
负对照，mRNA的同义链，无杂交信号。
正对照，UBQ10杂交信号遍布于整个胚珠。
mRNA的互补链，杂交信
号集中于纤维细胞中。
图6-5 用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达
荧光原位杂交技术FISH
（fluorescence in situ hybridization）
FISH的是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
荧光原位杂交
荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA 荧光原位杂交显示的端粒
6.1.4 定点突变技术
¾概念：
定点突变（site－directed mutagenesis）是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残疾对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、维修表达载体、引入新的酶切位点等。
9类型:
体外定点突变的具体方法有三种：
（1）寡聚核苷酸介导的定点突变；
（2）双引物法定点突变（重叠延伸技术）；（3）大引物诱变法。
以上三种方法虽不同，但原理都一致。
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目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。
9PCR介导的定点突变方法的优势:
1.突变体回收率高;
2.能用双链DNA作为模板，可在任何位点引
入突变;
3.可在同一试管中完成所有反应;
4.快速简便。
基因表达系列分析技术
外显子遗漏相互排斥剪切
5’选择性剪切3’选择性剪切
平衡剪切
选择性剪切的几种类型
寡核苷酸介导的DNA突变技术
重叠延伸诱变法示意图
图
6.2 基因敲除技术
6.2.1基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，
进而找出该基因的编码序列。
现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表
现型，进而推导出该基因的功能。
9概念：
基因敲除技术（gene knockout)又称基因打靶（gene targeting）。
这种技术是通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲入），然后从整体观察实验生物，从而推测相应基因的功能。
这种人为地把实验生物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。
基因打靶的必备条件
打靶需要两个必备条件：一是子弹，二是靶子。
同样的，基因打靶也需要其必备条件：一是要有将外源基因导入宿主细胞的载体；另一种就是能接受外源基因的受体。
9基因敲除分为：
完全基因敲除：是指通过同源重组法完全消除细胞或者生物个体中的靶基因活性。
条件型基因敲除：又称不完全基因敲除，是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。
噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
1. 完全基因敲除
图6-9用取代型（a）或插入型
（b）载体进行完全基因敲除实验
图6-10正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞
由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生了同源重组的胚胎干细胞，得用多种分子筛选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除的细胞系。
2. 条件型基因敲除
①构建条件型基因敲除打靶载体，将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入同向LoxP位点。
②需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交，Cre可把两个LoxP位点间的DNA片段切除，导致靶基因失活。
也可用Cre表达质粒转染靶ES细胞，通过重组将两个LoxP位点间序列删除（包括neo基因）。
图6-11 条件型基因敲除策略
基因敲除技术的应用：
1、研究基因调控和基因功能；
2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医
学研究提供材料；
3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新
功能，研究发育生物学；
4、治疗遗传病，即基因治疗。
5、改造生物、培育新的生物品种。
6.2.2 高等动物基因敲除技术
真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。
显微注射命中率较高，技术难度相对大些。
电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。
胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。
图6-12模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。
