测定细菌数量的方法

空缺中微生物检验方法

菌落总数测定

自然沉降法

1 原理：指直径9cm 的营养琼脂平板在采样点暴露5min ，经37℃、48h 培养后，计数生长的细菌菌落数的采样检测方法。

2 仪器：

2.1 高压蒸汽灭菌器

2.2 恒温培养箱

2.3 冰箱

2.4 平皿（直径9cm ）

2.5 制备培养基用一般设备

3 培养基

3.1 成分：

蛋白胨 10g

牛肉浸膏 3g

氯化钠 5g

琼脂 15～20g

蒸馏水 1000mL

3.2 制法：将上述各成分混合，加热溶解，校正pH 至7.4，过滤分装，121℃20min 高压灭菌，用自然沉降法时倾注约15mL 于灭菌平皿内，制成营养琼脂平板。 4 操作步骤：

4.1 设置采样点时，应根据现场大小，选择有代表性的位置作为空气细菌检测的采样点。通常设置5个采样点，即室内墙角对角线交点为一采样点，该点与四墙角对角线的中点为另4个采样点。采样高度为1.2～1.5m 。采样点应远离墙壁1m

以上，应避开空调、门窗等空气流通处。

4.2 将营养琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露5min ，盖上皿盖，翻转平板，置36℃±1℃恒温培养箱中，培养48h 。

4.3 计数每块平板上生长的菌落数，球场全部采样点的平均菌落数。以每平皿菌落数（cfu/皿）报告结果。

1 范围

本标准规定了化妆品微生物学细菌和霉菌总数的检验。

本标准适用于化妆品细菌和霉菌总数的检测。

2 规范性引用文件

GB 7916 化妆品卫生标准

GB/T 7918 化妆品微生物标准检验方法

QB/T 1684-1993 化妆品检验规则

3 一般规定

细菌总数是指1g或1ml化妆品中所含的活菌数量。测定细菌总数和霉菌总数可用来判明化妆品被微生物污染的程度，以及生产所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。

3.1 方法提要：

本标准采用标准平板计数法。化妆品中污染的微生物种类不同，每种微生物都有它一定

的生理物理特性，培养时对营养要求、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。

在实际工作中，不可能做到满足所有菌种的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使

用的条件下（在卵磷脂、吐温-80营养琼脂上，于37℃培养48h；在虎红琼脂培养基上培养72h)

生长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的微生物总数。

3.2 仪器

3.2.1 250ml锥形瓶。

3.2.2 电子天平、量筒。

3.2.3 压力蒸汽灭菌锅。

3.2.4 移液管。

3.2.5 灭菌培养皿：直径9cm。

3.2.6 酒精灯。

3.2.7 恒温培养箱。

3.2.8 放大镜。

3.3 培养基和试剂的制备

3.3.1 生理盐水： 氯化钠 8.5g

蒸馏水 1000ml

溶解后，分装到加适量玻璃珠的250ml锥形瓶内，每瓶90ml，经121℃(0.11 MPa)20min高温高压灭菌。

3.3.2 卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基：

制法：称取51g粉状卵磷脂、吐温80-营养琼脂成品培养基加入到1000ml纯水中混合,溶解均匀后分装,经121℃(0.11 MPa) 20min高温高压灭菌，储存于冷暗处备用。

细 菌 计 数

1、计数器测定法：

即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。

本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。

2、电子计数器计数法:

电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。

3、活细胞计数法

常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。

4、比浊法

比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。

此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。

5、测定细胞重量法

此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。

细菌总数的测定方法

测定细菌总数的方法通常包括以下几种：

1. 显微镜计数法：将待测样品制成适当浓度的悬浮液，然后使用显微镜观察计数。这种方法常用于观察对显微镜可见的大型细菌。

2. 平板计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，然后在固体培养基上均匀涂布。经过适当时间后，可数出单个菌落的数量，并根据稀释倍数计算出细菌总数。

3. 涂布计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，通过草屑涂布或涂布棒均匀涂布在固体培养基上。经过适当时间后，可数出涂布上细菌的总数。

4. 易液化琼脂凝胶计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，与液化琼脂凝胶混合，然后倒入琼脂凝胶平板上固化。经过适当时间后，可数出液化琼脂凝胶上细菌的总数。

5. 流式细胞仪计数法：将待测样品进行适当稀释后，通过流式细胞仪对样品中的细菌进行单个细胞的计数和分析。这种方法快速、准确，适用于大批量的细菌计数。

需要注意的是，不同的方法适用于不同类型的细菌和样品，选择合适的方法对准确测定细菌总数十分重要。此外，测定细菌总数时需要注意消毒、防止交叉感染等实验操作安全。