流式细胞仪常用的几种检测方法

流式细胞术临床检测项目操作流程

临床检测项目操作流程

1：淋巴细胞亚群测定 2：HLA-B27测定 3：CD55／CD59测定 4：血小板抗体测定 5：红细胞抗体测定 6：粒细胞抗体测定 7：白血病免疫分型测定

8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定 9：XL操作步骤

淋巴细胞亚群测定

(CD系列)

方法

流式细胞仪(BD)

原理：

双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。 标本采集与处理

受检者的准备： 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。 抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血 要求： 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS

稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。 试剂

品牌 规格 贮存 贝克曼库尔特

成分 1：单克隆抗体 1ML 2―8℃ 2：全血溶血试剂 A：甲酸 70ML 室温 B：碳酸钠等

流式细胞仪常用的几种检测方法

1.细胞计数和生存率检测：流式细胞仪可以通过测定细胞的大小、形状和胞内染色物来实现细胞计数和生存率的检测。通过自动聚焦和自动获取图像的功能，可以对大量的细胞进行计数和分析，并得出生存率数据。

2.表面标记检测：流式细胞仪可以利用荧光染料或荧光标记抗体对细胞表面的蛋白质、糖类或其他生物分子进行检测。这种检测方法主要用于检测细胞表面标记的数量和分布情况，例如测定细胞表面特定抗原的表达水平。

3.细胞周期分析：流式细胞仪可以通过染色剂或荧光标记抗体对细胞进行染色，然后分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。这种检测方法可以用于研究细胞的增殖能力、细胞周期调控机制以及细胞周期与疾病发展的关系。

4.细胞凋亡检测：流式细胞仪可以利用染色剂或荧光标记抗体对细胞凋亡的标志物进行检测。凋亡是细胞死亡的一种形式，通过测定凋亡细胞的数量和凋亡标志物的表达水平，可以研究细胞凋亡的调控机制以及细胞凋亡与疾病的关系。

5.细胞功能检测：流式细胞仪可以通过检测细胞内Ca2+浓度、ROS（活性氧物种）水平、蛋白质磷酸化等细胞功能指标来研究细胞的信号转导和功能活性。例如，利用荧光染料可以测定细胞内钙离子的浓度变化，以研究细胞响应外界刺激的机制。

此外，流式细胞仪还可以进行细胞分选、多色细胞分析和细胞细胞间相互作用的研究。细胞分选功能可以根据细胞标记物的表达水平将细胞分离出来，用于研究特定功能细胞的特性。多色细胞分析可以用于同时检测多种标记物的表达水平，以揭示不同细胞类型的分子特征。细胞间相互作用的研究可以通过检测细胞间的共聚或共表达标记物来研究细胞间的相互作用和相互影响。

总的来说，流式细胞仪是一种功能强大的实验室设备，常用于细胞生物学和疾病研究。通过不同的检测方法，可以在细胞水平上研究细胞的数量、表面标记、周期、凋亡、功能以及细胞间相互作用等方面的特征。

2.2.2.5 流式细胞术检测细胞周期

2.2.2.5.1 实验原理

用流式细胞仪检测细胞周期，通常用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染细胞核。PI在一定波长的光下发出荧光，其强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。

2.2.2.5.2流式细胞仪检测A549细胞周期步骤

收集对数生长期细胞，计数，以(1~5)×105/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日更换培养液，各孔分别加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次。每个浓度设3个重复。

48 h后，中止培养，胰酶消化后，收集细胞于流式管1000 r/min离心5min，弃上，冷PBS洗涤细胞3次，离心去上清；

一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀，4℃固定18 h以上；离心，弃去乙醇上清，加入预冷的PBS洗沉淀1次，离心去上清；

加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震荡混匀。室温、避光反应30 min；

流式细胞仪进行DNA检测，用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。

2.2.2.6流式细胞仪检测A549细胞凋亡

2.2.2.6.1实验原理

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35～36 kD的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

流式细胞仪主要技术参数

1.光学系统：

1.1*激光配置:配置488nm、638nm激光器，488nm、638nm激光功率都不低于50mW。可选配405nm激光，405nm激光功率不低于80mW。

1.2检测参数：至少可同时激发和检测4色荧光。

1.3光路设计：固定校准的光路设计，智能监控确保激光稳定工作。光学滤光片可由用户根据实际应用自行更换，无需专业人员调校。

1.4#采用新型检测器，能够达到5倍于传统高性能PMT的光电转换效率，每个通道配备独立检测器，电压可独立调节。

1.5*光信号收集系统, NA不小于1.3，能将大视野范围内的光信号准确地传递到接收光路中，最多可以支持到7个空间独立的激光同时激发的信号收集。

1.6* 系统具备进一步升级的能力，可升级至3激光13色。

2.分析性能：

2.1颗粒检测能力：可准确区分0.2um和0.3um的细胞或微粒。

2.2*荧光灵敏度：FITC的荧光灵敏度少于30 MESF，PE的荧光灵敏度少于10 MESF。

2.3荧光分辨率：CV≤3%（G0/G1期最高峰）。

2.4无需微球的绝对计数功能，在检测的同时即可自动计算样本浓度，结果准确。

3.电子系统：

3.1信号处理精度：20比特100万道原始信息量（1,048,576 channels）。

3.2高达107的线性动态范围，可以将高信号和低信号都完全显示在一张图上。

3.3支持多色荧光信号共同采集，信号获取速度（上样速度）达到30,000个/秒以上。

3.4荧光补偿：全矩阵荧光补偿，可脱机补偿，离线分析。 4.液路系统：

4.1自动化上样系统，具有自动混匀和自动清洗功能，降低样本间交叉污染。

4.2液流系统日常维护简单、清洗简便，开关机程序全自动完成，全部由自动软件控制。

4.3#上样速度：除常见低、中、高速外，用户可连续自定义样本进样速度（10-240uL/min）。

5.软件功能：

5.1操作系统：Window 7或以上版本。