sirna转染实验步骤及实验要点

siRNA细胞转染实验步骤

下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下siRNA转染步骤（24孔板）

1.提前1天细胞种植

贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。

悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。

2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。

注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵取1ul的EntransterTM-R4000，然后加入24ul无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。室温静置5分钟。

⑶将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。

注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

⑸转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA工作浓度优化的范围为5~100nM。

下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。

1. 在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。

注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。

2. 每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:

（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1）

（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。

（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。

表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表

细胞培养板 siRNA工作浓度 每孔培养基体积 siRNA用量 换算成20uM siRNA储液体积

细胞sirna转染操作流程

细胞siRNA转染操作流程

一、引言

细胞siRNA转染是一种常用的基因沉默技术，通过引入特异性小干扰RNA（siRNA）分子进入细胞内，靶向沉默特定基因，从而研究该基因的功能和调控机制。本文将介绍细胞siRNA转染的操作流程。

二、准备工作

1. 获得目标基因的siRNA序列。

2. 确定需要转染的细胞类型。

3. 准备细胞培养所需的培养基和细胞培养器具。

三、细胞处理

1. 将需要转染的细胞分散在培养基中，使细胞密度达到适宜的浓度。

2. 将细胞悬液均匀地分配到培养皿或培养板中。

3. 放置细胞在恒温培养箱中，使其在37摄氏度、5% CO2的条件下培养。

四、siRNA转染

1. 将合成的siRNA溶解在无菌去离子水中，得到一定浓度的siRNA溶液。

2. 向siRNA溶液中加入相应的转染试剂，如Lipofectamine 2000。注意按照厂家提供的操作步骤和比例进行加入。 3. 轻轻混合siRNA溶液和转染试剂，静置15-30分钟，使其形成siRNA转染复合物。

4. 将转染复合物滴加到细胞培养皿或培养板中，轻轻摇晃培养皿或培养板，使转染复合物均匀分布。

5. 放置细胞在恒温培养箱中继续培养。

五、培养细胞

1. 继续在37摄氏度、5% CO2的条件下培养细胞，观察细胞的形态变化。

2. 根据实验需要，可以在转染后一定时间点进行进一步的实验操作，如蛋白质检测、基因表达分析等。

六、细胞收集

1. 根据实验需要，可以在转染后一定时间点收集细胞。

2. 用PBS缓冲液洗涤细胞，去除培养基和转染试剂。

3. 用细胞裂解缓冲液裂解细胞，得到细胞裂解液。

七、实验分析

根据实验需要，可以对细胞裂解液进行进一步的实验分析，如Western blot、RT-qPCR等。

八、结果分析

根据实验结果，可以分析目标基因的表达水平和功能，从而深入研究其调控机制。

九、总结

细胞siRNA转染是一种重要的基因沉默技术，可以帮助研究者深入了解基因的功能和调控机制。通过遵循上述操作流程，能够有效地进行细胞siRNA转染实验，并取得准确可靠的实验结果。这项技术的广泛应用将为生命科学研究提供重要的支持。

上海细胞转染 rnaimax的si步骤

在上海，细胞转染是一种比较常见的实验技术，可用于将siRNA引入细胞中，为研究基因功能提供了有力的手段。在细胞转染 rnaimax 的 si 步骤中，需要注意以下几点。

1. 培养细胞：在进行细胞转染前，需要培养好细胞，并将其分装到相应的培养皿中。通常情况下，选用的细胞应该呈现良好的生长状态，且需要在适宜的时间点进行转染操作。

2. 制备siRNA：在进行细胞转染的过程中，需要首先制备好siRNA。siRNA的制备过程包括设计siRNA序列、合成siRNA、检测siRNA质量等步骤。在这个过程中，需要严格控制siRNA的纯度、浓度和稳定性，以保证其在细胞内的有效性和安全性。

3. 准备细胞转染试剂：在进行细胞转染操作前，需要准备相应的转染试剂。rnaimax 是一种常用的细胞转染试剂，能够有效地将siRNA引入到细胞内。在准备 rnaimax 试剂的过程中，需要按照厂家提供的说明书进行操作，以保证实验的准确性和稳定性。

4. 细胞转染操作：在进行细胞转染操作时，需要将制备好的 siRNA 和 rnaimax

试剂混合，形成一个转染复合物。然后，将复合物倒入到培养皿中，轻轻地摇晃培养皿，使其均匀分布在细胞上。在转染操作时，需要注意转染复合物的浓度、用量和时间等参数，以避免过度转染或者转染不足的问题。

5. 细胞处理：在细胞转染后，需要对细胞进行相应的处理。通常情况下，处理方法根据实验需求而定，可包括药物处理、光学显微镜观察、RT-PCR检测、Western blot检测等。在处理细胞时，需要注意实验条件的控制，以保证实验的准确性和可重复性。

总的来说，在上海进行细胞转染 rnaimax 的 si 步骤中，需要充分注意实验细节，严格控制实验参数，以获得可靠的实验结果。同时，为了确保实验的成功，建议选择专业的实验室进行技术服务，以获得最佳的转染效果和数据结果。